5种杜鹃幼苗的生理生化特性及耐热机制分析

5种杜鹃幼苗的生理生化特性及耐热机制分析

中国是世界上恢复和分布的杜鹃花植物的中心。虽然有丰富的野生花卉资源，但这些野生资源主要分布在中国西南部的海拔地区。受遗传因素的制约,该属植物喜冷凉、湿润环境,耐热性较差,高温热害是制约其迁地保育及园林应用的主要限制因子。杜鹃花种类繁多、遗传资源丰富,不同种间的生态习性和耐热性存在较大差异。为了探讨杜鹃花属植物的耐热机制及不同种间的适应性差异,近年来部分学者针对杜鹃花属植物开展了高温胁迫实验,筛选出一批与杜鹃花耐热性有关的形态及生理指标。然而,植物耐热性是受多基因控制的数量性状,且受环境条件的复杂性和植物对高温胁迫的适应性等多因子影响,故仅凭个别或少数指标的简单比较难以真实地反映植物耐热性的遗传本质。主成分分析法可以在不损失或很少损失原有信息的前提下,将原来数量较多且彼此相关的指标转换成新的个数较少且彼此独立的综合指标,并在此基础上计算出供试植物的每个综合指标值及其相应的隶属函数值,经加权求和可得到供试植物的抗逆性综合评价值。近年来,该方法已被应用于大白菜(BrassicapekinensisRupr.)、小麦(TriticumsestivumL.)和水稻(OryzasativaL.)等农作物和一些绿化植物的抗逆性评价,并取得了较为客观可靠的评价效果,但尚未见有关杜鹃花属植物耐热性鉴定与评价方面的研究报道。为探索和建立快速、有效的杜鹃花耐热性的鉴定方法,作者对高温胁迫条件下5种杜鹃花属植物实生苗的6个生理生化指标进行了测定和相关性分析,并应用主成分分析和隶属函数法对5种杜鹃的耐热性进行了综合评价,据此建立了最优回归方程,以期为杜鹃花属植物耐热性的鉴定、评价、预测及耐热种质的发掘和遗传改良提供理论依据。1材料和方法1.1种子和苗木来源供试种类有映山红亚属[Subgen.Tsutsusi(G.Don)Pojark.]的白花杜鹃[Rhododendronmucronatum(Blume)G.Don]、马银花亚属(Subgen.AzaleastrumPlanch.exK.Koch)的毛棉杜鹃(R.moulmainenseHook.f.)、羊踯躅亚属[Subgen.Pentanthera(G.Don)Pojark.]的羊踯躅[R.molle(Blume)G.Don]、常绿杜鹃亚属[Subgen.Hymenanthes(Blume)K.Koch]的红滩杜鹃(R.chihsinianumChunetFang)和杜鹃亚属(Subgen.RhododendronL.)的红棕杜鹃(R.rubiginosumFranch.),均为江西省·中国科学院庐山植物园内同批播种的4年生实生苗。2009年4月初,选取大小一致且生长健壮的5种杜鹃的4年生实生苗栽植于高9cm、上口径11.5cm、底径8.5cm的塑料盆中,每盆1株,栽培基质为当地林下的表层腐殖土,土壤中有机质和腐殖质的质量分数分别为10.87%和6.63%,速效氮、速效磷和速效钾的质量浓度分别为266.20、22.17和83.65mg·kg-1,pH4.79。供试苗置于常温温室中培养,采用日常养护管理方法,3个月后进行胁迫实验。1.2方法1.2.1自然气候条件分别设置22℃(对照)、30℃(轻度高温胁迫)和38℃(重度高温胁迫)3组处理;每组处理设3次重复,每一重复6株苗。实验在空气相对湿度80%、光照时间12h·d-1、光照强度120μmol·m-2·s-1的人工气候箱中进行。盆底设置托盘(水深1.0～1.5cm)补充基质水分。胁迫处理6d后,随机采集当年生功能叶(成熟叶),去除中脉;一部分直接用于丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量的测定;另一部分置于-70℃保存,用于超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定。1.2.2抗氧化酶mda、sod、cat、apx活性测定MDA含量的测定参照文献的方法并略加改进。称取0.5g新鲜叶片,加入体积分数20%三氯乙酸与体积分数0.5%硫代巴比妥酸的等体积混合液5mL及少许石英砂,研磨至匀浆;沸水浴中保温30min后,置于冰浴中迅速冷却;用3-18K离心机(德国Sigma公司生产)于10000g离心10min;取上清液,采用UV-3100PC扫描式紫外可见光分光光度计(上海美谱达公司生产)测定450、532和600nm处的吸光值,根据下列公式计算样品中的MDA含量:MDA含量=6.45×(A532-A600)-0.56×A450。采用文献的方法测定H2O2含量。于波长390nm处测定吸光值,并根据标准曲线方程y=70.185x-0.663(x为吸光值,y为H2O2含量)计算样品中H2O2含量。Pro含量测定参照文献的酸性茚三酮法并略加改进。取新鲜叶片0.5g,加入少许石英砂及5mL体积分数3%磺基水杨酸,研磨至匀浆;沸水浴中保温10min后,冰浴冷却,765g离心10min;取上清液1mL,加入1mL冰乙酸、1mL蒸馏水和2mL酸性茚三酮,混匀后置于沸水浴中保温60min,冰浴冷却后加入4mL甲苯,振荡30s,静置;取上层液于波长520nm处测定吸光值,并根据标准曲线方程y=34.793x+0.140(x为吸光值,y为Pro含量)计算样品中Pro含量。采用NBT光还原法测定SOD活性,以抑制50%氮蓝四唑(NBT)光化还原为1个酶活力单位;采用紫外分光光度法测定CAT活性,以1min内A240变化0.1为1个酶活力单位;采用文献的方法测定APX活性,以1min内A290变化0.01为1个酶活力单位。各指标均重复测定3次,结果取平均值。1.3不同温度下不同复配不同结构不同土主成分分析参照曾宪海等及张云等的方法。首先对各指标的原始数据进行标准化;计算各指标间的相关系数矩阵以及主成分贡献率和累计贡献率,并按累计贡献率大于或等于85%确定主成分个数;根据相关系数矩阵与初始因子载荷矩阵之间的关系求出特征向量矩阵(系数矩阵);建立主成分方程表达式并计算综合指标值。依据文献中的公式计算5种杜鹃在不同温度条件下各综合指标的隶属函数值U(xj)、各综合指标的权重Wj和各种类的耐热综合评价值D。实验过程中的数据处理、相关性分析、主成分分析、隶属函数计算和逐步回归分析等均运用Excel2007和SPSS17.0软件完成。2结果和分析2.1在高温条件下，对五种杜鹃生理生化指标的变化进行了分析2.1.1高温胁迫对不同植物叶片px活性的影响高温胁迫条件下,5种杜鹃丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)和脯氨酸(Pro)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性的测定结果见表1。由表1数据可见:与对照(22℃)相比,30℃和38℃高温胁迫条件下5种杜鹃叶片的各项生理生化指标均发生了变化,其中MDA、H2O2和Pro含量以及CAT和APX活性均随处理温度的升高而增加;在30℃胁迫条件下,SOD活性略高于对照,而在38℃胁迫条件下则低于对照。由表1还可见:高温胁迫条件下5种杜鹃叶片各项生理生化指标的变化幅度均存在较大差异,因而无法采用某一单项指标评价供试5种杜鹃的耐热性强弱,也说明植物的耐热性是一个复杂的综合性状。2.1.2活性指标间的相关性高温胁迫条件下,5种杜鹃6个生理生化指标的相关性分析结果见表2。由表2可以看出:6个生理生化指标间均存在着一定的相关性,其中有些指标间的相关性达到了显著或极显著的水平。SOD活性与APX活性呈显著负相关关系(P<0.05),与H2O2和Pro含量及CAT活性呈负相关关系;其他指标间均呈正相关关系。其中,CAT活性与H2O2和Pro含量及APX活性间均呈极显著的正相关关系(P<0.01),APX活性与Pro含量呈显著的正相关关系(P<0.05),从而使得它们所提供的信息发生了重叠。因此,直接利用这些指标难以准确地评价5种杜鹃种间的耐热性强弱,需要应用主成分分析方法。2.1.3主成分特征提取高温胁迫条件下供试5种杜鹃6个生理生化指标的主成分分析结果见表3。表3数据显示:前3个综合指标的贡献率分别为52.01%、19.20%和16.31%,累计贡献率达87.52%。表明前3个综合指标反映了原指标的绝大部分信息,可以代替原来6个生理生化指标对5种杜鹃的耐热性进行综合评价。将前3个综合指标分别定义为第1、第2和第3主成分,根据杜鹃6个测定指标的标准化值和综合指标的标准化特征向量(表3),可得到第1、第2和第3主成分的回归方程,分别为:CI(1)=0.1862X1+0.4098X2+0.4647X3-0.2287X4+0.5270X5+0.5010X6;CI(2)=0.6550X1+0.2441X2-0.0494X3+0.7072X4+0.0158X5-0.0913X6;CI(3)=-0.6239X1+0.2680X2+0.3529X3+0.4560X4+0.2558X5-0.3762X6。主成分特征向量为各主成分表达式中的原始变量标准化值的系数向量,它们代表了各变量对相应的主成分作用权数,即各单项指标对综合指标的贡献大小。由主成分方程式及表3结果可知:第1主成分特征向量较大的是CAT和APX活性,其次是Pro和H2O2含量;第2主成分特征向量最大的是SOD活性,其次是MDA含量;第3主成分中绝对值最大的特征向量是MDA含量(为负值),其次是SOD活性。高温胁迫条件下CAT和APX活性及Pro含量的增加均有利于活性氧的清除和维持细胞膜的稳定,因此第1主成分主要反映了高温胁迫条件下植物体内清除H2O2的能力,可定义为H2O2清除因子。SOD是清除O−⋅22-⋅的关键酶,对减轻活性氧引发的膜脂过氧化伤害具有保护作用,而MDA是膜脂过氧化作用的最终产物,也是衡量膜系统受害程度的重要指标,故第2和第3主成分可定义为维持生物膜结构稳定的因子。通过降维,可把原来6个相互关联的生理生化指标转换成3个新的相互独立的综合指标,并保留了原指标的绝大部分信息。对于同一综合指标而言,数值越大,说明某一种类在这一综合指标上的耐热性越强,反之则越弱。但是,杜鹃不同种类的耐热性并不是由某一个综合指标决定的,而是由3个综合指标共同决定的,而这3个综合指标的贡献率不同、所起的作用也不相同,因此应进行进一步的综合评价。2.2在高温条件下，对五种杜鹃的冷却和干燥进行综合评价和测试2.2.1不同种类林分不同热值的杜仲复合材料根据主成分表达式及隶属函数公式分别求得5种杜鹃在不同温度条件下的各综合指标值CI(x)及其隶属函数值U(x),详见表4。对于同一个综合指标而言,如CI(1),白花杜鹃在38℃胁迫条件下,其CI(1)值(3.2817)最大,对应的U(1)值(1.0000)也最大,表明38℃时白花杜鹃的综合指标CI(1)表现出最强的耐热性。根据贡献率大小及累计贡献率(表3)计算出各综合指标的权重,分别为0.5943、0.2194、0.1863(表4)。根据各综合指标的U(x)值和权重,得出5种杜鹃在不同温度条件下的耐热性综合评价值D(表4)。D值反映了不同种类的综合耐热能力大小,D值越大,表明其耐热能力越强。由表4可见:在38℃条件下,5种杜鹃的D值均最大;30℃条件下D值次之;而在22℃条件下D值最小。在同一温度条件下,5种杜鹃的综合耐热能力排序有一定差异:22℃条件下,5种杜鹃的D值由大到小依次为白花杜鹃、毛棉杜鹃、红滩杜鹃、羊踯躅、红棕杜鹃;30℃条件下依次为白花杜鹃、毛棉杜鹃、羊踯躅、红滩杜鹃、红棕杜鹃;38℃条件下则依次为白花杜鹃、羊踯躅、毛棉杜鹃、红滩杜鹃、红棕杜鹃。在3个温度条件下白花杜鹃的D值均最大,表明其耐热性最强;红棕杜鹃的D值均最小,表明其耐热性最弱。毛棉杜鹃D值较大、红滩杜鹃较小;在22℃条件下羊踯躅D值相对较小,但随着胁迫温度的升高其D值排序逐渐上升,说明杜鹃花对高温胁迫的耐性受到胁迫强度的影响,不同种类、不同胁迫强度下其耐热机制存在一定差异。2.2.2不同温度下抗高温能力的回归分析将不同温度条件下5种杜鹃的耐热性综合评价值(D)作因变量、各指标的标准化值作自变量,采用逐步回归法建立的最优回归方程为:D=0.4718+0.0313X1+0.0752X2+0.0663X3+0.0453X4+0.0724X5+0.0295X6。式中,X1、X2、X3、X4、X5和X6分别代表MDA、H2O2和Pro含量及SOD、CAT和APX活性的标准化值。6个自变量的偏回归系数均达到了极显著水平,回归方程的决定系数R2=0.9999,表明6个自变量可决定D值总变异的99.99%。用该回归方程对不同温度条件下5种杜鹃的耐热性进行预测,其预测值(表4)与综合评价值D在各种类及温度间的大小次序完全一致,两者高度相关(r=1)并达到极显著水平。说明该方程能够很好地量化各种类的综合耐热能力与各指标值间的因果关系,可用于对杜鹃种间耐热性进行科学准确的预测。3在不同温度下对管理系统所进行的综合评价植物耐热性不仅与其种类、发育时期、形态性状及代谢活动有关,且受逆境的发生时期、持续时间、胁迫强度和强弱变化以及研究的目的性状等多种因素的影响,是植物与环境相互作用的结果。不同植物耐热机制不同、对某一具体指标的耐热反应也不尽相同,单一指标难以准确、真实地反映植物的耐热性强弱,多种指标的综合评价则较为科学准确。但多指标的综合评价又存在以下问题:各指标间具有一定的相关性而使信息发生交叉与重叠,各指标在综合评价中的重要性(权重)也不同,因此不能直接利用多指标进行综合评价。本研究利用各指标间内在的深层次联系,采用主成分分析法将原来个数较多且彼此相关的指标转换成个数较少且相互独立的综合指标,克服了信息的重叠和指标间的相关性;并在此基础上计算出每个物种的综合指标值及相应的隶属函数值和权重,避免了人为确定权重的主观性;通过加权求和法,得到了每一物种在不同温度条件下的耐热性综合评价值,这样既考虑了各指标间的相互关系,又考虑了各指标的重要性,从而使获得的评价结果更为科学合理。主成分分析结果表明:6个原始指标可被转换成3个综合指标,累计贡献率达87.52%。在贡献率最大的第1主成分中,CAT和APX活性的特征向量较大,其次是Pr