疏肝健脾方药含药血清对脂多糖诱导的大鼠肝细胞lr4p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

疏肝健脾方药含药血清对脂多糖诱导的大鼠肝细胞lr4p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路的影响

非酒精肝脏疾病（nad）已成为世界公共卫生问题。世界发病率约为5%25%，中国约为15%。大多数nad患者仍处于简单的脂肪变化阶段，呈现良好或无意的非珠盐治疗过程，约3%5%的患者将进入低脂肪性肝炎（nash）。NASH与最终的纤维化,肝硬化和肝癌等终末期肝病密切相关。因此,NASH被认为在NAFLD的疾病演变进程中的重要阶段。NASH作为一种炎症性疾病,炎症在NASH中扮演了关键性的角色,炎症可以导致胞外基质和纤维化在肝脏中沉积。促炎细胞因子的释放及内质网应激在NASH的发展中起重要的作用,并且这些炎症反应不仅来自肝脏,还来自肠道内毒素和脂肪沉积。而肝细胞就是NASH重要的组织炎症来源之一。本课题组前期体内试验表明:NASH大鼠肝细胞TLR4/p38MAPK信号通路能够上调炎症介质IL-6,TNF-α表达,导致肝组织炎症损伤,肝功能受损。而疏肝健脾方药能够调控TLR4/p38MAPK信号通路,下调炎症介质IL-6,TNF-α表达,减轻肝细胞炎症损伤,但其具体作用途径有待于进一步明确。NASH在体研究日益深入之际,体外研究也广泛开展起来,国外有大量报道成功应用原代细胞培养来阐释NAFLD/NASH发病的分子机制。国内亦有应用革兰阴性菌细胞壁的主要成分LPS与其受体结合后,通过多种途径导致肝细胞炎症损伤用于NASH离体研究。这些为体外试验模型的成功建立,为研究NASH肝细胞损伤机制体外试验奠定了良好的基础。本次研究在建立LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤细胞模型基础上,针对中药复方成分复杂多样的特点,运用可信度、科学性、可行性都较以往应用中药粗制剂直接体外给药更高的血清药理学方法。观察疏肝健脾含药血清通过TLR4/p38MAPK信号通路对LPS刺激下大鼠肝细胞炎症损伤体外模型的影响的研究,通过结合体外试验及血清药理学2种方法,进一步探讨疏肝健脾方药防治NASH的药物作用途径及机制。1材料表面1.1syxk粤SPF级SD大鼠30只,体重(200±20)g,雌雄各半,暨南大学动物实验管理中心提供,动物许可证号SYXK(粤)2012-0117。1.2参茯苓白术散方疏肝健脾方药为柴胡疏肝散和参苓白术散的合方,柴胡疏肝散药物:柴胡6g,白芍5g,枳壳5g,川芎5g,陈皮6g,香附5g,炙甘草3g。参苓白术散药物:人参15g,茯苓15g,白术15g,白扁豆12g,莲子9g,山药15g,砂仁6g,薏苡仁9g,桔梗6g,炙甘草9g。以上药物均为深圳华润三九医药股份有限公司提供的中药配方颗粒剂,购自暨南大学附属第一医院中药房,方剂组成和药物剂量均参考《方剂学》。1.3试剂、试剂盒IV型胶原酶(美国Gbico公司);胎牛血清(德国Hyclone公司);RabbitpolyclonaltoCK18,RabbitpolyclonaltoED1,GoatantiRabbitIgG(H+L),FITCconjugated(镇江厚普生物科技有限公司);LPS,SB239063(美国Sigma公司);IL-6,TNF-αELISA试剂盒(上海依科赛生物制品有限公司);Anti-p38MAPK,Anti-phospho-p38MAPK(美国CST公司);Anti-TLR4(英国Abcam公司);CO2细胞培养箱(美国ThermoScientific公司);酶联免疫检测仪(美国ThermoScientific公司);Mini-subCELLgT电泳仪、凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。2方法2.1含药血清的给药剂量大鼠按随机数字表法分为3组,每组10只,分为正常组、疏肝健脾方药组(用于含药血清)、肝细胞提取组。根据李仪奎等提出的制备含药血清的给药方法,按给药剂量=在体实验的给药剂量×反应系统中被稀释的倍数,在体实验的给药剂量根据本课题组前期的研究中采用的合方组剂量为11.9g·kg-1,在下一步的细胞体外培养系统中将加入20%的血清,因此采取在体实验的5倍剂量,故给药剂量=11.9g·kg-1×5=59.5g·kg-1;正常组给予等体积生理盐水。2.2灌胃给药、去血大鼠均饲养于暨南大学动物实验管理中心SPF级实验室,开始给药前先自适应常规喂养7d。第8天起运用李仪奎等提出的血清药理实验通法方案开始灌胃给药,每天2次,12h1次,连续3d。末次给药后行腹主动脉采血,每只约8~10mL血液,以3000r·min-1离心15min分离出血清,对分离好的血清行热灭活处理。最后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌,冰冻保存备用。2.3细胞筛网率在前期细胞分离与鉴定的基础上加以改进,以1640培养基10mL,在无菌培养皿中,使细胞悬液流出,剪碎未完全消化的肝组织。细胞悬液分别经200目及300目细胞筛网,GBSS液垂悬,50×g3min×2次,4℃离心。离心沉淀物加GBSS液垂悬,50×g3min×2次,4℃离心洗涤,10%1640培养基垂悬所得沉淀,取悬液9∶1染色进行细胞计数,细胞终浓度调整为1×106个/mL,此即为分离所获肝细胞,接种于细胞培养瓶,置于37℃,5%CO2培养箱中培养。2.4疏肝健脾含药血清、p2p8mak信号通路阻断剂的筛选用LPS(40mg·L-1)刺激在体外培养的肝细胞,并分别用20%的疏肝健脾含药血清、p38MAPK信号通路阻断剂SB239063(2mg·L-1)予以干预,用空白血清组(20%空白血清)予以对照。2.5肝的形态、状态和评价在行Typanblue染色后,用倒置相差显微镜在细胞计数板进行细胞计数,并观察各组细胞状态,通过免疫荧光对肝细胞进行鉴定。2.6dmem/fps2基因文库制备当大鼠肝细胞在96孔细胞培养板上贴壁生长,状态良好,每孔细胞数量不少于1×104个时,加入不含血清的DMEM/F12基础培养基,然后再按各组药物干预方案添加药物至目标浓度后,放回细胞培养箱中培养24h后,吸取细胞上清,保存备用。用ELISA检测肝组织匀浆上清液中TNF-α,IL-6的质量浓度,具体操作严格按照说明书进行。2.7蛋白、肝胰腺组织中mmoll-1的检测取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride,PMSF),使PMSF的最终浓度为1mmol·L-1。计数新鲜分离的细胞,按照5×106~10×106个细胞加入1mL蛋白质裂解液(ightinferiorphrenicarteriesr,RIPA),4℃,1万~1.4万×g离心5~10min,吸尽上清,留下细胞沉淀备用。根据碧云天BCA蛋白浓度试剂盒说明书对蛋白含量进行测定。肝细胞样本进行凝胶电泳、转膜、封闭、一抗孵育、4℃过夜。洗涤后加入二抗,孵育,充分洗涤,然后进行化学发光。曝光、显影、定影,最后对结果进行吸光度扫描分析。2.8统计学处理方差分析用SPSS13.0统计软件进行数据分析,计量资料用ue0af±s表示,组间比较使用完全随机设计资料的方差分析,P<0.05时差异具有统计学意义。3结果3.1kupffer细胞数量每只大鼠可获得纯化后的肝细胞数量为1.5×108~2.0×108个,纯化后的Kupffer细胞数量为0.5×107~1.0×107个。吸净培养基后,用PBS冲洗细胞2次,用胰蛋白酶消化后行Typanblue染色,用细胞计数板在倒置相差显微镜下进行细胞计数,测定细胞活力均在95%以上。3.2贴壁细胞的形态刚提取出的大鼠肝细胞体呈圆球形,色泽透亮,边界清晰;12h细胞贴壁后,细胞呈圆形或椭圆形,色泽更为光亮,体积增大,边缘伸展,见图1。对肝细胞做CK18免疫荧光鉴定,可见圆球形的肝细胞呈绿色荧光,肝细胞呈CK18阳性表达,见图2,说明提取的为肝细胞。3.3两组小鼠血清中细胞形态变化正常组肝细胞生长良好,色泽透亮,部分细胞体积增大,出现分裂增殖,LPS+正常血清组可见部分细胞脱落,细胞浆内出现空泡,胞浆颜色变淡,部分细胞胞核消失,细胞形态出现异常,不再呈圆球形或椭圆形,正常血清组、疏肝健脾方组及SB239063组与正常组比较未见明显差异,见图3。3.4两组il-6,tnf-表达水平比较与正常血清组比较,LPS组肝细胞培养上清中IL-6,TNF-α水平均有明显升高(P<0.01),各药物干预组肝细胞培养上清中相关炎症因子表达水平大部分均有不同程度的降低,SB239063组、疏肝健脾组与LPS组IL-6,TNF-α表达水平相比较差异显著(P<0.01或P<0.05),见表1。3.5对lp8mak的比较与正常血清组比较,大鼠肝细胞LPS组p38MAPK通路相关蛋白表达皆有显著升高(P<0.05或P<0.01)。在p38MAPK的表达上,LPS组与正常血清组及正常组比较表达水平明显上调(P<0.05);与LPS组相比较,SB239063组p38MAPK明显下降(P<0.01),疏肝健脾组亦有所下调,但无显著统计学差异,见图4。对于p-p38MAPK而言,LPS组相比较与正常血清组、正常组明显上调(P<0.01),与LPS组对照,SB239063组、疏肝健脾组下调均显著(P<0.01),见图5。在TLR4的表达上,LPS组与正常血清组及正常组比较表达水平有所明显上调(P<0.01),疏肝健脾组下调TLR4的水平具有显著统计学差异(P<0.05),而SB239063组对TLR4表达水平下调无显著统计学差异,见图6。4中国语境下tlr4/3gp8mak基因表达有研究表明肠源性内毒素在单纯性脂肪变性向NASH疾病发展进程中发挥重要的作用,肠道菌群内毒素通过血液循环首先就直接导致肝损伤,这也是近年来NASH肠-肝轴理论形成的基础。内毒素主要包括细菌LPS,肽聚糖,脂蛋白和各种脂肽,LPS是内毒素最重要的组成部分。LPS被证实能够通过增加大鼠肝组织TNF-α,IL-6炎症介质的表达,加重NASH严重程度。而本次体外研究表明:与正常血清组相比较,LPS组TNF-α,IL-6炎症介质表达增加(P<0.01),而LPS导致肝细胞TNF-α,IL-6炎症介质表达增加可能是肝组织TNF-α,IL-6炎症介质的表达增加,肝脏炎症损伤的重要组成部分。有研究表明内毒素通过TNF-α,IL-6加重NASH肝损伤程度的假说,可能与Toll样受体机制的作用相关,但其具体机制尚不清楚。Toll样受体,作为病原体的传感器,有助于适应性免疫应答和炎症的调节和代表肠道菌群的变化,内毒素血症和肝损伤之间的连接,同时Toll样受体是固有免疫系统的主要的病原模式受体之一,TLRS通路的激活在严重反应中起着重要的作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)是哺乳动物细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,其参与了细胞增殖、分化、转化及凋亡的调节,并与炎症及其他多种疾病发展密切相关。p38MAPK是MAPKS家族中控制炎症反应最重要的家主成员之一,p38MAPK能够促进白细胞的聚集和活化,调节转录因子的活性和细胞因子的合成,对炎症反应的调控起着关键性的作用。TLR4是第一个被发现的哺乳动物TLR,也是p38MAPK的上游分子,TLR4/p38MAPK通路上下游之间的关系,LPS是TLR4的最重要的配体,由LPS与TLR4相结合,通过系列级联反应,启动TLR4介导的信号通路。在通过髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)依赖反应通路,激活人肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6,TRAF-6),并与接头蛋白TAK1激活蛋白因子(TAK1-bindingprotein1TAB1)相结合,再激活(转化生长因子β-激活性激酶1,TGFβ-activatedkinase1,TAK-1)。TAK-1是TLRS通路和MAPKS的连接纽带。因此,TLR4最终激活p38MAPK的活化,同时p38MAPK的活化又与IL-6,TNF-α,IL-10等炎症因子的表达密切相关。本研究表明:LPS组肝细胞中LPS刺激TLR蛋白表达增加,激活导致p38MAPK蛋白表达及磷酸化,较对照组有显著统计学差异(P<0.01),且LPS组IL-6,TNF-α炎症介质表达明显增加(P<0.01),提示TLR4/p38MAPK信号通路可能是LPS刺激IL-6,TNF-α炎症介质表达明显增加重要通路。古代并无NAFLD的病名,但当代中医药工作者已经就NAFLD可以归属古代“肝癖、肝著、胁痛”等病达成专家共识,大样本临床流行病学研究表明当今NAFLD的患病人群证候特点主要以肝郁脾虚证、脾虚湿痰证最为常见。本课题组前期的研究