粪便中芽孢杆菌的分离和鉴定

-.z.粪便中芽孢杆菌的别离和鉴定实验原理：通过对粪便的处理，对其进展细菌别离，选择出芽孢杆菌。芽孢杆菌多为革兰氏阳性菌，需氧或者兼性厌氧。通过普通培养基进展细菌培养，观察其菌落的形态、特征。对典型的菌落进展革兰氏染色和芽孢染色。之后进展普通培养基、血琼脂培养基、固体培养基培养。之后进展过氧化氢、VP实验、淀粉水解、柠檬酸盐利用、硝酸盐复原、甲基红实验、吲哚产生实验、苯丙氨酸脱酸实验、葡萄糖的水解实验、阿拉伯糖、木糖、甘露醇、乳糖的分解实验、液化明胶实验、硫铵水解实验等生理生化实验。对细菌进展16srDNA序列测序，测GC碱基的所占比例、PCR测序，确定具体为何种芽孢杆菌，最后进展小鼠毒性实验。实验材料粪便锥形瓶、烧杯、载玻片、玻璃棒、胶头滴管玻、璃珠、培养皿、移液管、移液枪及枪头小试管、试管、细玻璃棒、接种环、接种针、搪瓷缸、水浴锅、纱布、冰箱、摇床、酒精灯、蒸馏水、无菌水、恒温培养箱、高压锅、电炉、pH试纸、PH计吸水纸、显微镜、秒表、天平、电子称、电子天平、温度计、记号笔、滤纸、塞子、纱布、冰箱PCR仪、微量移液器、一次性手套、小鼠、手术刀、注射器草酸铵结晶紫溶液、碘液、石碳酸溶液、95%酒精、碱性美蓝溶液、3%过氧化氢溶液、肌酸/肌酐、40%氢氧化钾、无菌羊血清、3%淀粉溶液、柠檬酸钠、硫酸镁、磷酸二氢钾、琼脂、磷酸一氢钾、氯化钠、溴麝香草酚蓝酒精溶液、硝酸钾、蛋白胨、1%氢氧化钠、对氨基苯磺酸、5mol/L醋酸、α-萘胺、脱脂棉、二苯胺、浓硫酸、葡萄糖、、甲基红溶液、DL-苯丙氨酸、酵母浸液、10%氯化铁、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、甘露醇、0.2%溴麝香草酚蓝水溶液、1%溴麝香草酚蓝水溶液、HL-葡萄糖培养管、硫胨、牛肉膏、明胶、、对位二甲氨基苯甲醛、无水乙醇、青霉素、反响缓冲液、2mM脱氧核苷三磷酸底物、耐热DNA聚合酶、实验步骤3.1粪便的处理;取样品1g，加至带玻璃珠的含100mL无菌水的锥形瓶中，静置20min后，在摇床上20r/min充分振荡30min，将样品液于80℃水浴15min，取10mL样品液均匀涂布在制备好的普通营养琼脂平板上，37℃过夜培养3.1.1普通肉汤培养基配方：牛肉膏5g、蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、蒸馏水1000mL配制：按上述要求称量〔先称盐类、蛋白胨、牛肉膏〕，至于铝锅或者搪瓷缸；将上述成分混合加热溶解后，以0.1mol/L氢氧化钠调整PH为7.4~7.63.1.2普通琼脂培养基的制作配方：普通肉汤500ml〔牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、磷酸二氢钾、蒸馏水〕、琼脂10g〔在液体培养基参加琼脂1.5%~2%为固体培养基、参加0.3~0.5%为半固体培养基〕配制：1〕将称好的琼脂加到普通肉汤，加热煮沸待琼脂完全融化，分装试管或用于制备琼脂平板。分装试管每管约4~5ml。分装完毕塞好棉塞，包扎好待灭菌。2)高压蒸汽灭菌后，趁热将试管口的一端放在玻璃棒上，使之有一定的浓度，凝固后即成普通琼脂斜面。也可直立，凝固后即成高层琼脂。3)剩余局部的普通琼脂以手掌感触，假设将琼脂瓶紧紧手中感觉烫，但仍能紧握时，即为倾倒平皿的适宜温度〔50~60℃〕.每只灭菌培养皿倒入10~15ml，将培养皿盖上，并将培养皿于桌面上轻轻回转，使培养皿平铺于皿底，即成普通琼脂平板。3.1.3鲜血琼脂培养基的制备1〕将灭菌的普通琼脂培养基加热融化，待冷却至50℃，参加无菌的脱纤绵羊或者家兔的鲜血5%~6%混合后，分装灭菌试管，立即摆成斜面或者倾注于灭菌平皿〔琼脂温度过高参加后为紫褐色，过低时鲜血参加不凝固，不易混合。混合时切勿产生气泡〕。待凝固后，至37℃无菌检验24h，无杂菌生长方可应用。2〕无菌血液采用无菌操作采自安康动物，将血液加到盛有5%灭菌枸橼酸钠或者3%灭菌肝素的100ml三角瓶，至冰箱待用。3.2细菌的别离：将上清液接种于营养肉汤，37℃,200r/min培养24h，,取培养液80℃水浴15min，杀死非芽孢杆菌，接种于营养肉汤，37℃，200r/min富集培养20h。3.3：细菌的纯化：取富集菌液梯度稀释10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，选择三个适宜的梯度混菌划线别离〔划线法先将平板置于30℃〔24-48h〕或37℃〔18-24h〕，无菌检查，外表冷凝水枯燥〕。每个梯度二个平皿，将平板倒置，于35℃-37℃24-48h。对长出的单菌落进展编号，选择生长快、菌落大，外表枯燥，粗糙，不透明的菌落转接于斜面培养。挑取少许菌苔涂片，做芽胞染色判断是否为芽孢杆菌。3.3.1细菌的制涂片备：取一块干净的载玻片，各滴一滴无菌水于载玻片中央，用接种环以无菌操作法在火焰旁从菌种上挑取少许菌体于水滴中，混匀并涂成薄膜，枯燥，固定。3.3.2革兰氏染色1〕涂片、枯燥、固定2〕滴加草酸铵结晶紫溶液，经1~2min，用冲洗瓶水洗，直立，枯燥。3〕滴加碘液1~3min，水洗。4〕加95%酒精脱色，0.5~1min，水洗。5〕加稀释的石碳酸复红/黄水溶液复染10~30s，水洗。6〕用吸水纸吸干，枯燥，有油镜观察。结果判定：革兰氏阳性菌呈蓝紫色；革兰氏阴性菌呈红色。3.3.3芽孢染色1〕涂片，枯燥，固定。2〕滴加石碳酸复红染液，加热至产生蒸汽，染色5min，水洗。3〕脱色：滴加95%酒精，脱色2min，至淡红色为止，水洗。4)复染;滴加碱性美蓝溶液，60s，水洗。5〕枯燥，镜检结果判定：芽孢呈红色，菌体呈蓝色3.4生理生化实验3.4.1过氧化氢酶〔触酶〕试验实验步骤：方法一：取干净的载玻片，在上面滴一滴3%过氧化氢溶液，挑取一环斜面培养的试验菌，放在过氧化氢溶液中混匀，假设有气泡出现，则为过氧化氢酶试验阳性；无气泡产生者为阴性。方法二：取2ml3%的过氧化氢参加到干净的小试管中，用细玻璃棒蘸取实验菌，插入到过氧化氢液面以下，假设有气泡为阳性方法三：将1mL3%过氧化氢滴加在生长物菌落上，有气泡产生为阳性。注意：试验菌不应培养在含有血液的培养基，易造成假阳性反响；不能铂环代替玻璃棒，会反响产生气泡；每次反响应设立对照，阳性对照菌为金黄色葡萄球菌，阴性为链球菌3.4.2VP实验 1、培养基：同MR试验2、试剂：①奥美拉式试剂：0.3g肌酸或者肌酐溶于100ml40%氢氧化钾即成②贝立脱氏试剂：甲液为6%α-萘酚酒精溶液，乙液为16%的氢氧化钠溶液③硫酸铜试剂：1g硫酸铜溶于40ml氨水中，再加10%氢氧化钠至1000ml3、实验步骤：1〕将被检细菌接种到葡萄糖蛋白胨水中，置37℃培养48h。2〕在培养物中参加等量的奥美拉式试剂〔或硫酸铜试剂〕，混合，或1ml培养物参加0.5ml贝立脱氏试剂甲液和乙液振荡混合，观察结果。3〕结果判定：在5min呈现粉红色为阳性；长时间无反响，置37℃培养4h或室温过夜。颜色仍不变者为阴性3.4.3淀粉水解实验1、培养基配方：营养琼脂90ml、无菌羊血清〔只对不易生长的细菌才加〕5ml、无菌3%淀粉溶液配制：将琼脂加热融化，冷却至50℃时，以无菌操作法参加无菌羊血清及无菌淀粉溶液，混合均匀后倾注平板。试剂：革兰氏碘液2、实验步骤：1〕将待检菌划线接种于上述平板上，置37℃培养24h2〕形成菌落后，在菌落处滴加革兰氏碘液，以铺满菌落周围为宜，观察颜色变化。3〕结果判定：培养基呈现蓝色，能水解淀粉的细菌其菌落周围出现无色透明圈。3.4.4柠檬酸盐利用试验1、培养基：西蒙式培养基配方：柠檬酸钠1g、硫酸镁〔Mgso4.7H2o〕0.2g、磷酸氢二钾1g、琼脂20g、磷酸二氢铵1g、氯化钠5g、1%溴麝香草酚蓝酒精溶液10ml、蒸馏水1000ml配制：将除琼脂和溴麝香草酚蓝溶液外的各成分溶解后，调解pH6.8~7.0，参加琼脂融化，再参加溴麝香草酚蓝溶液，分装试管，经121℃灭菌15min，制成斜面备用。2、实验步骤1〕将待检菌在培养基上先划线再穿刺，37℃培养观察2~4d。2)结果判定：阳性者在培养基斜面上生长，并且西蒙式培养基由草绿色变为蓝色。3.4.5硝酸盐复原试验1、需氧菌培养基：配方：硝酸钾0.2g、蛋白胨5g、蒸馏水1000mL配制：将各成分溶解，调pH7.4，试管分装，经121℃灭菌20min试剂：甲液：将0.8g对氨基苯磺酸溶解于100mL5mol/L醋酸即成乙液：将0.5gα-萘胺徐徐加热溶解于100mL5mol/L醋酸后，用脱脂棉过滤即可。二苯胺试剂：二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20mL蒸馏水稀释。实验步骤;1)将待检菌接种到培养基上，同时设立对照，37℃培养观察4d，每天取培养液少许放入两支返京的小试管中，每个试管再滴加甲液和乙液各一滴，对照管同样处理，观察结果。2〕结果判定：如试管菌液呈现红色、橙色者为阳性反响。如无红色出现，则可加一滴二苯胺试剂，此时假设呈现蓝色反响，则表示培养基中有硝酸盐的存在；假设不呈蓝色反响，则表示硝酸盐和形成的硝酸盐已被复原成其他物质，仍应记为硝酸盐复原实验阳性反响。3.4.6甲基红〔MR〕试验1、培养基：配方：蛋白胨0.7g、磷酸氢二钾0.5g、葡萄糖0.5g、氯化钠0.5g，蒸馏水100ml配制:将上述成分混合于蒸馏水中，加热溶解，调解pH7.2~7.4，滤纸过滤，分装与小试管，每管3~5ml，加塞包好，经115℃灭菌20min后备用。试剂：甲基红0.02g、95%酒精60ml、蒸馏水40ml实验步骤：1〕将待检菌接种于培养基，置37℃培养48h。2〕取少量培养液于另一小试管，参加几滴指示剂，观察颜色变化，假设无颜色变化可继续培养4~5d再进展试验。3〕结果判定：培养液呈现红色表示为阳性；呈现黄色为阴性。3.4.7苯丙氨酸脱氨实验1、培养基配方：DL-苯丙氨酸2g、氯化钠5g、琼脂12g、酵母浸膏3g、磷酸氢二钠1g、蒸馏水1000ml配制：将上述培养基配方中的各成分混合于蒸馏水中，加热溶解后，调解pH为7.4，过滤分装，115℃灭菌20min。趁热制成斜面备用试剂：10%三氯化铁溶液器材：恒温培养箱、高压锅、电炉、搪瓷缸、。接种针、ph试纸、小试管实验步骤1〕挑取大量待检菌培养物，接种到上述培养基斜面上，37℃培养18~24h，在生长好的细菌的培养基斜面上滴加0.2ml〔4~5滴〕10%三氯化铁溶液2〕结果判定：斜面变绿为阳性；否则阴性3.4.8葡萄糖酵解实验〔O/F试验、HL试验〕1、培养基：配方：蛋白胨0.2g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾0.03g、葡萄糖1g、琼脂0.5g、蒸馏水100ml、1%溴麝香草酚蓝水溶液0.3ml配制：除指示剂意外，溶解以上各成分、调解pH6.8~7.0，再参加指示剂，分装试管，115℃灭菌20min。2、实验步骤：取两支HL葡萄糖培养管，至沸水中10min，冷却后将实验菌穿刺接种。其中一支用灭菌的液体石蜡覆盖隔绝空气，为封闭管，亦检测发酵特征；另一管不加液体石蜡，为开管，暴露于空气以检测氧化特征3、结果判定：假设两管均不变色，为碱型或者不活动型，O/F实验为阴性；两管均产酸变为黄色为发酵型；封闭管不产酸颜色不变，开管产酸变为黄色为氧化型3.4.9阿拉伯糖、木糖、麦芽糖、甘露醇、乳糖分解实验1、需氧菌适用的培养基配方：蛋白胨1g、氯化钠0.5g、蒸馏水100ml、糖/醇物质0.5~1g、0.2%溴麝香草酚蓝水溶液1.2ml配制：除指示剂之外，溶解各成分，调PH为7.4~7.6，参加指示剂混匀，分装试管。管事先装有倒置的小玻璃管。如在培养基中参加0.5~0.7琼脂，制成半固体培养基，可不用倒置的小管。经115℃灭菌20min2、实验步骤：1〕按照培养基配方，选择培养基，高压灭菌并做无菌检验后备用2〕取培养18~24h的实验菌，接种于培养基中〔如为半固体应穿刺〕，置37℃培养数小时至2周后观察结果3〕结果记录：指示剂由紫色变为黄色，表示糖类产酸，以“+〞表示；假设指示剂由紫色变为黄色且试管倒置的小管有气泡出现，则表示产酸产气，以“〞表示；假设指示剂未改变，则表示对糖类不发酵，以“—〞表示。〔注：半固体糖发酵培养基做穿刺接种，除观察产酸产气外，尚可观察细菌的运动性〕3.4.10硫铵试验1、培养基〔三氯化铁明胶培养基〕：配方：硫胨25g、氯化纳5g、牛肉膏7.5g、明胶120g、10%三氯化铁水溶液配制：将除三氯化铁水溶液以外的成分混合，加热融化并高温灭菌，趁热参加预先灭菌的10%三氯化铁水溶液，混匀，无菌分装小试管，直立凝固。器材：恒温培养箱、高压锅、电炉、搪瓷缸、小试管、pH试纸、接种针实验步骤;用接种针取待测菌沿管壁做穿刺接种，37℃培养观察2~7d。结果判定：明胶变黑为阳性，否则为阴性。3.4.11液化明胶试验1、明胶培养基：配方：蛋白胨5g、牛肉膏3g、明胶120g、蒸馏水1000mL配制：将上述成分混合，置流动蒸汽灭菌器，加热溶解，调节pH7.0~7.2，用纱布过滤，分装试管，121℃灭菌15min。实验步骤;1)挑取培养18~24h的待检菌，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。于20~22℃培养7~14d，明胶高层也可培养于36℃左右。另取一只未接种的培养基作对照，每天取出两支试管，放入冰箱20~30min，再