蛋白质组学研究中质谱技术的应用

蛋白质组学研究中质谱技术的应用

蛋白质组学是一个全面的过程，研究了细胞中蛋白质的组成、活动规律以及蛋白质与蛋白质的相互作用。这是功能因素研究时代的一门新学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)和基质辅助激光解析离子化(matrixassistedlaserdesorptionionization,MALDI)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分析的离子化和分子质量大的测定问题,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(iontrap,IT),飞行时间(timeofflight,TOF),串联飞行时间(TOF-TOF),四级杆/飞行时间(quadrupole/TOFhybrids),离子阱/轨道阱(IT/orbitraphybrid)和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(IT/Fouriertransformioncyclotronresonancemassspectrometershybrids,IT/FTMS),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的MS/MS谱。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术已在蛋白质组学研究中处于核心地位。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化特定细胞生命过程中的功能性分子,例如质谱技术可在一次研究中鉴定几千个蛋白质分子,并可以给出蛋白质存在的分子修饰状况;质谱分析还可以用于了解蛋白质与蛋白质之间的相互作用。因此,有学者认为基于质谱的蛋白质组学最终可以进行整个生物系统的蛋白质表达水平的研究,并认为蛋白质组学可以成为“新基因组学”。笔者主要综述质谱在蛋白质组学的应用。1质谱定量测定蛋白质组学最初的研究焦点是蛋白质的鉴定,最近基于质谱发展起来的平台有利于研究细胞内蛋白质组分数量变化。在整体水平上研究蛋白质的定量分析被称为定量蛋白质组学(quantitativeproteomics),对于系统地理解每个蛋白质组分的分子功能有着重要的作用,将为各种生物学过程和生物系统提供新的见解。蛋白质组是复杂多变的,即使在一个细胞中不同生理或病理条件下,蛋白质的表达也不相同。目前质谱越来越多地被用于蛋白质或肽的相对或绝对定量的研究。典型的基于质谱定量蛋白质组学研究可用质谱谱图特征(谱峰的强度,质/荷比和出峰的时间)、肽的特征(来源相同肽离子的质量同位素峰)、或肽(相同肽不同电荷状态的多个肽特征)来表示。定量蛋白质组学技术可以分为两类,即标记定量技术和非标记定量技术。定量蛋白质组学研究的目的是通过比较多个样品质谱相关信息的丰度变化进行定量,且通过控制假阳性率(false-discoveryrate,FDR)提供差异丰度特征的最大程度列表。定量蛋白质组学工作流程可分为3类,即稳定同位素标签、谱峰计算和谱峰特征分析。1.1体外标记技术稳定同位素标签是一种标记定量技术,用稳定同位素标记蛋白质样品﹑混合样品﹑酶解、质谱分析,并分为体内标记技术和体外标记技术。例如体内标记技术稳定同位素标记氨基酸细胞培养(stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture,SILAC),在培养介质中加入稳定同位素标记的氨基酸进行蛋白质的鉴定和定量,但是该技术只能对可培养的样品进行定量分析。体外标记技术同位素标记的亲和标签(isotope-codedaffinitytag,ICAT)是利用ICAT试剂在体外标记不同状态蛋白质样品中的半胱氨酸,酶解后用亲和柱分离纯化标记的肽段再进行质谱分析,比较适合两个样品的定量比较。随后又出现了多重元素体外标记技术如同位素标记相对和绝对定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation,iTRAQ),可对4~8种不同的样本同时进行定量分析。由于外源试剂的引入使得质量发生变化,因此需在相同的质谱运行条件下对肽的谱特征分别定量,谱峰的信号强度可作为定量的依据。标记技术准确﹑灵敏,但也存在着标记反应复杂及对标记稳定同位素的成对质量峰的区分需要更高分辨率的质谱仪器等缺点。1.2相对丰度的检测基于质谱的定量蛋白质组学研究也可用无同位素标记的方式进行定量研究,优点在于试验简单、不需要同位素标记﹑动态范围大。该策略中比较的样品要分别用质谱进行分析,但要用相同的数据采集提取步骤,并以肽段被质谱检测的计数为基础,再通过归一化来表征被检测蛋白质的相对丰度。质谱检测计数法认为肽段在质谱中被检测到的频率与其在混合物中的丰度成正比,因此,蛋白质被质谱检测的计数体现了蛋白质的丰度。相对于标记定量蛋白质组学研究方法来说,质谱检测计数法存在对低丰度蛋白质的定量准确性低的缺点,但该方法仍具有广泛的应用前景。1.3基于质谱的无标记定量技术谱特征分析法法的工作流程与稳定同位素标签及质谱检测计数不同,定量前不需要肽序列的鉴定。无标记的定量蛋白质组学研究策略中,生物学样品分别单独运行质谱,通过计算机工具建立特征谱,如肽段峰强度、峰面积、液相色谱保留时间等信息进行蛋白质丰度的定量。该项技术允许分析大量的谱特征和高通量的数据,因此适合多重样品分析,缺点是由于大量杂散的特征和噪音增加了计算的复杂性及在不同数据采集过程中要求严谨性、稳定性和重现性。基于质谱的无标记定量蛋白质组学具有广泛的应用前景,但内在的偏差和数据的变异等给定量带来了巨大的挑战。最近有学者开发和测试了一种归一化的无标记定量方法,即归谱指数法(normalizedspectralindex,SIN),整合了质谱丰度的3个表征:肽计数、谱计数和片段离子的强度。SIN能够在很大程度上消除重复质谱分析所带来的变异,而且使得定量具有重复性及可量化相同或不同样品的重复质谱分析所得的上千个蛋白质。2翻译后修饰的调控蛋白质的翻译后修饰控制着基因型和表型的许多生物学过程,据不完全统计,已知有300多种翻译后修饰参与生理过程。因此,研究翻译后修饰的多样性,对理解细胞水平、生物体水平的表型建成、调节机制等十分关键。质谱是研究蛋白质化学修饰的关键技术,可以定位修饰位点﹑定量化学修饰蛋白及检测新型结构。翻译后的修饰种类很多,如磷酸化、乙酰化、泛素化及半胱氨酸氧化等。2.1段离子的质量迁移蛋白质磷酸化是细胞调控和信号传导的关键机制。据估计,在真核细胞中约有1/3的蛋白质通过蛋白质激酶和磷酸化酶活性调节发生了磷酸化修饰。蛋白质磷酸化是增加了HPO3基团,可通过增加80u的氨基酸残基质量数来检测,磷酸位点的检测可通过磷酸化肽片段离子的质量迁移来鉴定。翻译后修饰的离子特征可用一级质谱或串联质谱扫描监测,对于MALDI-TOF质谱鉴定蛋白质磷酸化可对比前后图谱,寻找质量数变化为80u或98u及强度增大的信号,则可能是磷酸化肽段。以ESI为离子源的质谱在磷酸化肽段检测中具有广泛的应用前景,通过前体离子扫描和中性丢失扫描来检测磷酸化肽段。蛋白质磷酸化的质谱分析主要集中在两方面:一是磷酸化肽段的寻找;二是磷酸化位点和磷酸化数量的确定,其中磷酸化位点的确定是肽段磷酸化分析的难点。磷酸化蛋白质是一些低丰度蛋白质,因此,富集磷酸化蛋白是磷酸化蛋白质组学的前提。目前富集磷酸化蛋白和肽段的方法主要利用抗体富集和化学方法修饰改变磷酸基团的特异性分离纯化,如IMAC固定金属螯合亲和层析,随着该富集方法的改进,为磷酸化蛋白质组学研究提供了更广泛的研究前景。2.2乙酰化肽的富集赖氨酸ε-氨基和氨基酸N端的乙酰化对诱导活化裂解产生的肽片段是稳定的,并且可通过与未修饰的形式比对特征性的+42.01u质量偏移进行检测。尽管三甲基赖氨酸与乙酰赖氨酸的质量相似,但它们的结构可以通过高分辨率的质谱进行辨别。由于电荷中性化的原因在乙酰赖氨酸残基中胰蛋白酶的酶切位点被封住,所以乙酰化肽可以作为漏切产物被检测到,其序列与未乙酰化修饰肽的序列不同。乙酰化肽的富集非常困难,原因在于乙酰化氨基不轻易被衍生,因此,一般对部分纯化的混合物进行乙酰化研究。这种观点已改变了最近开展的大规模乙酰化蛋白筛选研究,通过采用树脂结合抗体乙酰赖氨酸来富集乙酰化肽,大量的乙酰赖氨酸位点已被定位。最近的蛋白质组学研究中发现,蛋白质乙酰化新的化学物质,如O-乙酰丝氨酸和苏氨酸残基作为乙酰辅酶A的基团转移产物,这个反应酯化了MAP激酶的关键丝氨酸残基,进而干扰了激酶和磷酸化的活化。最近在组蛋白和其他赖氨酸靶位点上赖氨酸残基的丙酰化和丁酰化已有报道,这揭示了赖氨酸位点的化学修饰要比以前认识的更为复杂。2.3泛素化蛋白质的纯化众所周知,泛素和类泛素化蛋白在调控蛋白质稳定性、活性、细胞定位及降解方面具有重要的作用。泛素是凭借泛素连接酶E3共价耦联目标蛋白,通过异肽连接泛素C末端羧基和靶蛋白赖氨酸的ε-氨基,这些修饰对质谱鉴定构成了巨大的挑战,原因在于胰蛋白酶的酶切位点是赖氨酸和精氨酸的C端肽键,由于泛素化蛋白质的赖氨酸被泛素基团保护而漏切;另外,泛素化蛋白胰蛋白酶水解可释放甘氨酸-甘氨酸双肽的C末端,导致赖氨酸在分子质量上产生一个质量移位为114.1u的信号。但在甘氨酸-甘氨酸共价结合赖氨酸部位胰蛋白酶裂解被抑制,产生漏切产物,其质量范围大于诱导活化裂解的适合范围。目前基于多维液相色谱分离和ESI-MS/MS正被用于探究由泛素修饰或类泛素修饰蛋白质所产生的大肽段。在蛋白质中有些位点会经常发生泛素化,突变研究显示并不是所有位点都是蛋白酶识别所需要的,这实际上削弱了调控位点在大规模研究中所需要富集来有效检测功能性的靶位点。目前,纯化泛素及类泛素化蛋白质最直接的方法是在泛素及类似物的N端加一个多肽标签尾巴,进而利用标签来纯化泛素及类泛素化蛋白质,缺点是标签的加入可能影响与泛素相关修饰酶及底物蛋白的结合,泛素化抗体的出现将可以避免此问题发生。此外,有关泛素化和类泛素化修饰的数据库已经出现,更有利于靶位点的鉴定。3定向蛋白质组学定向蛋白质组学是基于质谱技术快速检测目标蛋白的技术,该技术具有灵敏度高、重复性好的特点。基于质谱的鸟枪蛋白质组学研究是将蛋白质酶解,片段化成肽片段进行质谱分析。理论上,这种方法可以分析样品中的所有蛋白质,但在实践应用中有着巨大的挑战。但是对于一些不以发现新蛋白为研究目的,而是研究特定条件相对少量蛋白质的变化来观察其参与的特定相互作用或信号传导途径的试验来说,可采用定向蛋白质组学(targetedproteomics)研究策略,方法是采用选择反应监测(selectedreactionmonitoring,SRM)和多反应监测(multiplereactionmonitoring,MRM),这两种方法本质上是同样的实验模式。SRM过程是选择一个特征性的母离子做串联质谱分析,在其碎片中再选择一个特征的子离子作为监测离子。SRM早期主要应用于分析小分子化合物,最近才被应用到蛋白质组学领域。目前,RuediAebersold团队致力于该技术的研究并推动其发展,他们应用定向蛋白质组学分析了酿酒酵母的全动态范围的蛋白质组,检测到每个细胞低于50个拷贝的蛋白质,这是鸟枪蛋白质组学不能匹敌的。有学者认为在未来的5年,定向蛋白质组学研究将会取代蛋白质免疫印迹杂交来进行蛋白质表达量的验证,该方法具有蛋白质免疫印迹杂交的灵敏度和重复性,优势在于验证特异性的速度快。蛋白质免疫印迹定量肽可能需要花费3个月的时间,而定向蛋白质组学分析只需要几天。目前该方法还不能广泛地应用到蛋白质组学中,主要原因在于建立用于分析全蛋白质组学的SRM数据库是一项非常耗时的工作。但相信随着该技术的快速发展,将有利于高通量、高灵敏度检测不同生物学样品中蛋白质的鉴定和定量分析。4质谱的组学研究蛋白质组学研究中有两个不同的基本方法:其一是基于表达的蛋白质组学研究,主要利用传统的双向电泳技术研究细胞、组织、器官或不同生物系统对外界刺激或不同病理状态下所表达的所有蛋白质。虽然该方法在一些研究中已取得了成功,但是仍存在着一些弊端,如生物系统中蛋白质表达的动态范围问题,往往一些调控蛋白因其表达量很低而被高丰度蛋白所掩盖;遗传和环境的变异导致基因和蛋白质表达的多变性,给基于质谱的蛋白质组定量研究带来困难;此外,翻译后修饰在调控细胞生物过程中有着重要的作用,但是目前可用的技术很难全面和定量地进行分析。其二是功能蛋白质组学研究,与表达蛋白质组相学比有着根本和策略上的不同。利用基于质谱蛋白质组学方法鉴定细胞、亚细胞或有机体蛋白质,并阐明对细胞生物过程和信号传导途径一些重要见解。大部分细胞的功能是由蛋白质复合物来执行和完成的。目前有多种不同的技术方法来研究功能蛋白质组学,如亲和纯化和表面等离子共振技术、蛋白质芯片技术、酵母双杂交和噬菌体展示技术及计算机模拟技术等。通过这些方法所获得的数据需要用质谱技术进行鉴定与已知蛋白相互作用的未知蛋白质,其可以在几个小时内鉴定数千种蛋白质,并结合生物信息学对数据进行整合和解释。基于质谱的功能蛋白质组学在相关生理背景条件下利用现代灵敏的质谱技术来差异分析蛋白质复合物进而阐明蛋白质与蛋白质之间的相互作用,例如,利用功能蛋白质组学系统分析了酵母细胞的蛋白质复合物的组成并获得了前所未有的蛋白质相互作用的大量信息。功能蛋白质组学最终的目的是通过生成一个总体规划来描述所有的分子、分子的功能、外界刺激的反应及相互关系来破译整个细胞的分子功能。然而,基于质谱的功能蛋白质组学的成功应用还远未达到,原因在于未能捕获感兴趣的蛋白质复合物、质谱分析中有限的动态范围和灵敏度、谱图的不完整解释及数据库检索中无法进行数据的大量分析等。虽然存在着一些问题,但随着质谱技术的不断发展,基于质谱的功能蛋白质组学将可以作为了解感兴趣靶蛋白生物功能的常规工具,并提供较多的机会来寻找潜在的新的靶标蛋白质。5白质组学信息质谱分析所产生的数据解读和分析是基于质谱蛋白质组学研究的一项重大挑战,也是许多蛋白质组研究计划的瓶颈。基于串联质谱蛋白质组学信息,是通过蛋白酶酶解多肽混合物后进入多维液相色谱预分离,在一级质谱中进行肽段离子化,被选的母离子在碰撞室内经碰撞诱导解离片段化所产生子离子片段离子谱而获得的。如何正确地根据获得的肽谱确定肽序列是蛋白质组学数据处理的首要步骤。目前已有大量的计算方法和软件工具可自动化地根据肽谱确定肽序列,大体可以分为3类:数据库检索、从头测序和“混合”方法。5.1分子质量/能量匹配系统通过质谱的肽离子谱获得的肽序列与数据库中已有的预测的理论蛋白质序列比对进行蛋白质的鉴定。目前已有许多串联质谱数据检索的搜索引擎,它们的工作方式是通过输入肽片段离子的m/z(质量/电荷比值),根据数据库中已有的理论肽片段的模式进行计算分值。基于一系列的检索标准如质量误差范围﹑选择使用的酶和翻译后的修饰类型等获得了一些候选蛋白质。程序所输出的是一系列依据评分标准获得的与片段离子匹配的肽序列。目前国际上常用的蛋白质数据库主要有SWISS-PROT、TrEMBL、PIR-PSD和UniPro等。5.2基于数据库检索的从头测序根据肽离子谱直接明确地读取肽序列称为从头测序。最初这项工作是人工完成的,但最近几年一系列工具的开发已可辅助研究者完成从头测序任务。从头测序优于数据库检索体现在可以确切鉴定肽的序列,还