快速高分辨液相色谱-质谱联用技术在血浆组学研究中的应用

快速高分辨液相色谱-质谱联用技术在血浆组学研究中的应用

1血浆检测的难点及对策代谢组学是一项研究生物内源性代谢的一般和变化规律的科学。作为系统生物学的重要组成部分，它在药物、药理学等领域得到了迅速发展，并在药物筛选和其他领域得到了成功应用。人体血浆作为代谢组学研究中的重要体液样本,其中含有2000多种内源性小分子代谢物,与常见的尿液样本相比,前处理过程相对复杂。首先,由于含有大量的蛋白质类成分,因此进行HPLC-MS分析前需要去除蛋白质;其次,由于血浆中所含成分种类繁多、极性跨度很大,既有高极性的氨基酸、葡萄糖、核苷类等,也有低极性的脂类、固醇类等代谢物。代谢物成分的复杂性增加了血浆样品分析的难度与挑战。本研究采用快速高分辨液相色谱-质谱联用技术(Rapidresolutionliquidchromatography-massspectrometry,RRLC-MS)技术,针对血浆样品前处理中常用的有机溶剂沉淀蛋白法与固相萃取方法进行了比较,并进行了方法优化及方法学考察;采用主成分分析(Principalcomponentanalysis,PCA)对穿插在检测序列中的质量控制(Qualitycontrol,QC)样品数据进行统计分析,最终建立了适合于代谢组学研究的血浆样品前处理方法。2实验部分2.1仪器、标准品及测量体Agilent1200SeriesRRLCsystem(德国WaldbronnAglientTechnologies公司);QTRAPTM四极杆-线性离子阱串联质谱仪(美国AppliedBiosystems/MDSSCIEX公司),配有ESI源和AnalystQS1.5数据处理系统;乙腈、甲醇、乙醇、丙酮和甲酸(色谱纯,Merck公司);标准品分别购自Fluka公司、Sigma-Aldrich公司及中国药品生物制品检定所;实验用水为超纯水。人血浆样品(EDTA抗凝),采自中国医学科学院北京协和医院,采集后立即于-80℃冷冻保存。2.2流动相和线性梯度洗脱条件ZorbaxAq-C18色谱柱(100mm×2.1mm×1.8μm;美国Agilent公司);流动相:A为H2O(含0.1%formicacid);B为CH3CN。线性梯度洗脱:0～20min,0～100%B;20～23min,100%B。每次进样前,色谱柱在初始流动相条件下平衡8min,流速250μL/min。柱温60℃;进样量5μL。2.3dp气大设ESI离子源,分别采用正、负离子EMS扫描模式,喷雾电压为5500～4500V,解簇电压(DP)为50～-50V,源温度375℃,雾化气为7.5MPa,干燥气为6.5MPa,气帘气为4.0MPa,扫描范围为65～850Da。数据采集和处理采用Analyst1.5数据处理系统。2.4标准物质和样品的制备2.5x-ms-msx-ms由RRLC-ESI-MS检测获得的QC样品最初数据经过WifftomzDatatranslatorsoftware(version1.0.0.4,AppliedBiosystems/MDSSciex)转换成XCMS可识别的mzData格式,阈值设置为1%。采用XCMS进行保留时间校准、峰识别、滤噪、峰匹配,获得可视化的原始二维数据阵。获得的数据矩阵导入多变量统计软件SIMCA-Psoftware12.0(UmetricsAB,Umeå,Sweden)进行PCA分析。3结果与讨论3.1提取方法的优化本研究对血浆处理中常用的有机溶剂沉淀法(包括4种不同的溶剂系统:甲醇、乙腈、甲醇-乙醇(1∶1,V/V);甲醇-乙腈-丙酮(1∶1∶1,V/V)和固相萃取方法进行了系统分析。空白血浆中加入5μL混合标准品1,采用不同方法进行前处理,通过对各处理方法获得的总离子流图中色谱峰数量、峰强度及混合标准品1中各化合物峰面积的考察,获得每种方法对各成分的提取效果,结果如图1所示。从图1可见,16个化合物经过沉淀蛋白处理后均可得到检测,而经过SPE处理后有3个化合物(烟酸,肌酐和半胱氨酸)未被检测到。此外,对不同方法处理后的色谱峰强度进行比较发现,大部分化合物在经乙腈沉淀处理后获得的强度最高,而SPE处理后化合物的提取效果较差,这是由于SPE处理时极性大的化合物在固相萃取柱上的保留效果较差,以致流失;虽然蛋白与小分子的亲和作用,使得在有机溶剂沉淀蛋白时一部分小分子化合物也会随着蛋白一起沉淀而损失,但是与SPE中化合物的流失相比,大部分化合物,尤其是极性较大化合物的提取效果更好,因此,目前诸多研究中血浆前处理也采用乙腈沉淀法。对乙腈沉淀蛋白方法中沉淀溶剂的体积及温度进行了优化。分别选择血浆与乙腈的体积比为2∶1,3∶1,4∶1,5∶1的溶剂系统对沉淀体积进行比较,结果表明,3倍体积的乙腈对大部分化合物的提取效果最佳(图2)。溶剂的温度优化为冷溶剂(乙腈放入4℃冰箱冷藏24h)与室温溶剂的效果比较(图3),结果显示,冷藏保存的乙腈有更佳的提取效果。该结果与文献的结论一致,确证了冷溶剂进行提取方法的有效性。3.2研究方法的结果3.2.1标准品的检测仪器的精密度考察:将配制的标准品混合溶液2分别稀释10、50和100倍(即配制为10倍体液浓度、2倍体液浓度、体液浓度的10种标准品混合溶液)。稀释后的混合液2分别进行RRLC-MS检测分析,通过连续进样6次,计算各色谱峰保留时间和提取离子色谱峰峰面积的RSD值。结果表明,在10倍体液浓度溶液中10个标准品化合物的RSD值均小于15%,8个化合物RSD值小于5%;尤其是在检测信号强度较低(Peakarea≤107)时,RSD均小于5%;2倍体液浓度和体液浓度溶液中10个标准品化合物RSD指均小于15%;检测信号强度较低(Peakarea≤107)时,RSD均小于10%。人体内的部分微量代谢物对维持机体正常的生理活动至关重要。本结果说明,在使用代谢组学方法找到的可能生物标志物中,即使提取离子峰强度较低的代谢物的可靠性也较高。方法的精密度考察:分别取混合标准品2溶液6,3和1.5μL,加入150μL空白血浆中,采用3倍体积乙腈沉淀法进行样品前处理,高中低3个浓度水平分别平行测定6次;采用RRLC-MS进行检测,并计算相应化合物的提取离子色谱峰面积RSD值。结果显示,10个标准品化合物在3个浓度下的RSD值均小于20%,表明方法的精密度良好。3.2.2不同冷冻循环处理对同一份血浆样品分别进行冻融1,2和3次处理(每组重复处理2次),考察冻融循环后样品的稳定性。具体步骤如下:取6份相同血浆各150μL,分别标记为①～⑥,①②加入7.5μL混合标准溶液后按前处理方法处理;③～⑥加入7.5μL混合标准溶液后20℃冷冻保存;样品复融,③和④加入7.5μL混合标准溶液后按2.4(2)节步骤继续处理;⑤和⑥融化后再一次20℃冷冻,4℃融化后按2.4(2)节步骤处理。经过不同冷冻循环处理后的样品,测定标准品中所含化合物的提取离子峰峰面积,并计算RSD值,结果均小于15%。结果表明,样品经不同冻融循环后,不会引起数据统计学上的差异,样品冻融稳定性良好。3.3回复突变实验结果采用本方法对大批量血浆样本进行代谢组学分析,连续进行5次测定QC样本,使系统达到平衡,每分析10个血浆样本穿插1次QC样本的检测。图4是分别在正、负离子检测模式下,17次QC样本经RRLC-MS检测的结果进行PCA分析后,各样本在第一个主成分上的投影结果。结果表明,17次检测中前5次的偏差较大,之后9次偏差控制在2SD范围内。该结果也表明,大批量样品分析的精密度良好,测试样本之间的差别主要来自于样本中代谢物的差异,而不是来自分析方法的误差,说明代谢组学研究中发现的生物标志物的可靠性。通过方法学考察后,最终确定的血浆前处理方法流程图如图解1