在体单向肠灌流法研究瑞香素肠吸收机制

在体单向肠灌流法研究瑞香素肠吸收机制

对药物设计中残留的残余作用具有重要意义。目前预测药物小肠吸收状况的方法主要分为离体法和在体法。在体法中的大鼠单向肠灌流法能很好地模拟人体的体内环境,且结果与人体试验结果相关性良好,得以广泛应用。祖师麻为瑞香科植物黄瑞香(DaphnegiraldiNitsche)、陕甘瑞香(DaphnetanguticaMaxim或DaphneretusaHemsl)的干燥茎皮和根皮,具有祛风湿,活血止痛的功效。临床上主要用于风湿痹痛、关节炎、类风湿性关节痛。前期实验发现祖师麻中的瑞香素(也称祖师麻甲素)含量较高,且与抗炎镇痛和免疫作用密切相关,为祖师麻治疗类风湿性关节炎的主要活性成分。上世纪80年代初,国内有学者对瑞香素的代谢及药代动力学进行了研究。结果表明,瑞香素半衰期较短,主要经肾排泄,且排泄较快,在体内能快速分布并消除。但由于当时条件有限,研究尚不够深入,限制了祖师麻药材及制剂的进一步开发和利用。本文采用大鼠在体单向肠灌流模型考察瑞香素的吸收特性,以揭示瑞香素的肠道吸收机制,从而为瑞香素及祖师麻的剂型选择和新剂型开发提供科学依据。ph、小鼠肠道吸收瑞香素的检测仪器TU-1800S紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Agilent1100型高效液相色谱仪,HP1100型二极管阵列检测器,AgilentChemStation色谱工作站(Agilent科技有限公司);BT00-300M恒流蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)。药品及试剂瑞香素原料药(金坛市思达化工有限公司,纯度98%);瑞香素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0900-200102);酚红(上海试剂三厂);水合氯醛(中国医药集团上海化学试剂公司);甲醇、冰醋酸(色谱纯),其他试剂均为分析纯。动物SD大鼠,雌雄各半,体重300~350g(南京中医药大学实验动物中心)。溶液的配制瑞香素对照品储备液的配制:取瑞香素对照品适量,精密称定,置于10mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容,摇匀得质量浓度为0.814mg·mL-1的溶液,4℃放置,备用。瑞香素原料药储备液的配制:取瑞香素原料药20mg,精密称定,用DMSO0.5mL溶解,得到40mg·mL-1的原料药储备液,摇匀,4℃放置,备用。含酚红的Krebs-Ringer试液(K-R试液,pH6.0):称取CaCl20.37g,葡萄糖1.4g,分别加少量蒸馏水使溶解,再称取酚红20mg、NaCl7.8g、KCl0.35g、NaHCO31.37g、NaH2PO40.32g、MgCl20.02g,加蒸馏水溶解后与溶解的CaCl2及葡萄糖混匀,蒸馏水定容至1L,再用1mol·L-1HCl调pH值为6.0,备用。瑞香素肠灌流液的配制:精密吸取瑞香素原料药DMSO储备液适量,用含酚红的K-R试液稀释定容至200mL,配制质量浓度为10、20和40μg·mL-1的供试液。空白肠灌流液:K-R灌流液适量,按下述“大鼠在体单向肠灌流实验”方法灌流,收集流出液,即得。大鼠在体单向肠灌流实验取禁食(不禁水)16h的大鼠,称重,10%水合氯醛麻醉(3.4mL·kg-1),沿腹中线打开腹腔,小心分离出待考察肠段,即十二指肠、空肠、回肠和结肠,取约10cm于两端切口插管,结扎,用预热至37℃的生理盐水将肠内容物冲洗干净,再用空气将生理盐水排净。实验时取不同浓度的供试液(预热至37℃)200mL,先以1.0mL·min-1的流速灌流10min,再将流速调为0.2mL·min-1,预平衡30min后,于30~60、60~90、90~120、120~150min时间段收集灌流液样品。取样品0.5mL测定酚红浓度,其余样品立即酸化后,经0.45μm的微孔滤膜滤过,取续滤液进样,测定峰面积,计算各个时间段灌流液样品中瑞香素的含量。采用上述实验方法分别考察瑞香素浓度、pH、肠段及P-gp等各因素对瑞香素肠道吸收的影响。最后剪取各个被灌流的肠段,测量肠内径以及长度。灌流液中酚红浓度的测定取含瑞香素对照品和酚红的K-R试液、不含酚红的瑞香素的K-R试液以及含酚红的K-R试液各0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R试液3.5mL,摇匀,于400~700nm进行可见光扫描,确定测定波长及方法的专属性。采用K-R缓冲液配制含酚红10、20、30、40、50mg·L-1的系列标准液,分别吸取0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R试液3.5mL,摇匀,测定吸收度,以酚红质量浓度(C,mg·L-1)对吸收度(A)进行线性回归,得标准曲线方程。取酚红质量浓度为10、30和50mg·L-1样品进行回收试验,考察酚红回收率。于一定时间点移取灌流液样品续滤液0.5mL,加入1mol·L-1NaOH溶液1mL、K-R试液3.5mL,摇匀,测定吸收度,代入标准曲线方程,计算酚红浓度。灌流液中瑞香素浓度的测定HPLC色谱条件为HederaODS-2色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为甲醇-0.5%冰醋酸(20∶80,v/v),流速1mL·min-1,柱温30℃,检测波长327nm。在上述色谱条件下,将空白、含药灌流液分别进样,考察其方法的专属性。精密吸取瑞香素对照品储备液,以适量的K-R缓冲液将其分别稀释为40.70、24.42、20.35、10.18、5.09μg·mL-1,分别以0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液,进样20μL,以质量浓度(C,µg·mL-1)对峰面积(A)进行线性回归,求得标准曲线方程。用空白肠灌流液配制低、中、高(10.18、24.42、40.70μg·mL-1)3个浓度的瑞香素溶液,分别进样,测定峰面积,考察瑞香素的回收率。于一定时间点移取灌流液适量,0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液按照上述色谱条件进样分析。将测得的瑞香素的峰面积代入标准曲线方程,计算相应浓度。瑞香素在不同pH值的K-R液中稳定性考察采用HCl和NaOH溶液调节K-R缓冲液得到pH值分别为6.05、7.43、8.08,加入20μg·mL-1瑞香素,37℃水浴条件下放置,分别于0和3h取样,测定瑞香素的含量。以峰面积计算降解残存百分率。瑞香素在空白大鼠肠灌流液中稳定性考察取空白大鼠肠灌流液(pH6.0)配制药液,置于密闭容器中,于37℃的水浴中放置,分别于0和2h取样,测定瑞香素的含量,以峰面积计算其降解残存百分率。数据分析本文采用酚红法对灌流液的流入和流出的体积进行校正,消除其体积变化的影响。在体大鼠单向肠灌流实验中所测得的出口处的瑞香素的浓度用公式(1)校正:瑞香素的有效渗透系数Peff用公式(2),吸收速率参数Ka用公式(3)计算:式中Cout(corrected)和Cout分别为出口处经校正后的瑞香素的浓度和实际测得的瑞香素的浓度;Cin灌流液中瑞香素的浓度;PRin、PRout分别为入口处和出口处酚红的浓度;Q为肠道灌流液的流速(0.2mL·min-1);L和r分别为被灌流肠段的长度和内径(cm)。利用统计分析软件SPSS11.5处理数据,当P<0.05时判定具有显著性差异。结果以表示。结果1酚红标准曲线酚红的测定波长为558nm,肠灌流液中瑞香素对酚红的测定没有干扰。求出酚红标准曲线方程:A=0.1247C-0.009,r=0.9996(n=5)。酚红在10~50mg·L-1线性关系良好。平均回收率为102.13%,RSD为1.22%。2素标准曲线方程空白肠灌流液对瑞香素的测定没有干扰,在测定波长327nm处,瑞香素标准曲线方程:A=158.33C-286.68,r=0.9993(n=5)。瑞香素在5.09~40.70μg·mL-1线性关系良好。回收率为98.21%~99.00%,RSD为0.61%~1.03%。3.1瑞香素在不同ph值的k-r溶液中的稳定性研究3.2瑞香素在白色大鼠肠流液中的稳定性研究4不同浓度瑞香素在体内吸收nd10、20、40μg·mL-1的瑞香素在不同肠段的吸收参数见表4。本研究为多样本均数的两两比较,各处理组间采用LSD检验(即Q检验)分析各个肠段及不同浓度之间的差异性。结果表明,瑞香素的质量浓度在10~40μg·mL-1内,随着浓度的增加,其吸收有上升的趋势,在高浓度无饱和现象,低浓度与高浓度比较,空肠及结肠的Peff有显著性差异(P<0.05),表明瑞香素在小肠内吸收无自身浓度抑制作用,瑞香素可能以被动扩散的机制吸收进入体循环。另外,同一浓度下进行十二指肠、空肠、回肠、结肠灌流时发现,在十二指肠、空肠、回肠的Peff、Ka之间无显著性差异(P>0.05),瑞香素在小肠吸收较好,且在小肠无特殊的吸收窗。5p-gp外排作用对瑞香素吸收的影响取pH6.0的20μg·mL-1的瑞香素溶液200mL(含盐酸维拉帕米100μmol·L-1)为灌流液,考察瑞香素的吸收是否受到P-gp外排作用的影响(表5)。结果表明,盐酸维拉帕米对瑞香素在各肠段的有效渗透系数(Peff)以及吸收速率参数(Ka)未见显著性影响(P>0.05),说明瑞香素可能不是P-gp的底物。体肠灌流实验药物在体肠吸收研究中,应注意体系的密封性以及整个管路容器对药物的吸附与解吸附,要求对输送灌流液的管路质地有较好的选择。通过预实验可知,灌流30min,从管路出来的灌流液能达到一个稳态。因此,实验设计灌流30min后流出液进行采集,充分保证实验数据的可靠性。小肠吸收的过程中,不仅吸收药物也吸收水分,使供试液的体积减小,故不能用直接计算药物浓度的方法计算剩余药量。本实验采用在肠道生理pH条件下不被肠道吸收的酚红来标定灌流液的体积,进而更为准确地计算剩余药量。此外,在体单向肠灌流实验采用了较低的灌流速度(0.1~0.2mL·min-1)和较短的灌流时间,减小了灌流对肠壁的损伤,避免了酚红被吸收,使酚红可以很好地起到标示体积的作用。瑞香素为香豆素类化合物,在碱性条件下易开环,在酸性条件下以非解离状态存在,稳定性较好。本实验室前期采用在体肠循环实验研究瑞香素的吸收特征时,发现瑞香素在肠道内的吸收随着肠道pH值升高而增加,可能是由于肠道pH值升高碱性增强使得瑞香素发生了降解,从而将瑞香素降解的部分误以为被肠道吸收。因此本实验将瑞香素溶解在pH6.0的K-R试液中进行在体肠灌流,保证了瑞香素在灌流液中的稳定性。取样后的样品需进行酸化以保证样品测定的稳定性,避免降解带来的误差,较好地反映瑞香素在大鼠体内的吸收特性。虽然无法排除灌流时单次通过时间内(30min)发生的降解量,但是由于十二指肠到回肠的pH值大致在5~7.5,灌流过程中pH值的变化不会很大;而结肠的pH在7~8之间,可能有些影响。本实验研究发现酸化后,与结肠相比,瑞香素在小肠吸收较好,且不存在特异性的吸收部位,瑞香素的吸收机制可能为被动扩散。当某化合物在大鼠平均Peff小于0.03×10-4cm·s-1或大于0.2×10-4cm·s-1时,可以预测该化合物在人体内分别为吸收差或吸收完全。由本实验可知,瑞香素属于高渗透性药物。此外,加入P-gp抑制剂盐酸维拉帕米后,瑞香素的吸收没有增加。说明瑞香素可能不是P-gp的底物。上述研究结果提示,瑞香素或祖师麻口服剂型的设计时可以考虑采用适宜的辅料避免瑞香素在肠道内的降解或制成pH依赖型制剂,使其较大程度在胃肠道上端释放并被吸收。3段空白大鼠肠灌流液中的稳定性20μg·mL-1瑞香素在pH分别为6.05、7.43、8.08的K-R液中稳定性见表1。由表可见,瑞香素在pH6.0即弱酸性条件下的K-R液中较稳定。瑞香素在