lr2、lr4和lr9在大鼠结肠炎模型结肠组织中的表达

lr2、lr4和lr9在大鼠结肠炎模型结肠组织中的表达

样本受体（tr）是一个天然免疫系统的膜受体。它可以与病因学相关的分子结合，开始信息转化，然后生成序列因子（nf）引起b国激活，并引起炎症介质的出现。因此，它是天然免疫和得少性免疫的联系，可以在一些革兰氏疾病中发挥重要作用。本实验通过观察大鼠结肠炎模型结肠组织中TLR2、TLR4和TLR9的表达,并结合疾病活动度、大体损伤评分、组织学评分和超氧化物歧化酶(SOD)、髓过氧化物酶(MPO)活性进行分析,旨在探讨三者在炎症性肠病(IBD)发病机制中的作用。材料和方法一、材料表面1.实验动物和动物清洁级Sprague-Dawley大鼠20只,体质量200~230g,雌雄各10只,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。动物饲养于25℃净化实验室内,混合饲料喂养,自由饮水。2.主要试剂和仪器2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBSSigma公司),SOD、MPO检测试剂盒(南京建成生物工程研究所),TLR2、TLR4、TLR9兔抗鼠多克隆抗体(SantaCruz公司),免疫组化SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司),TLR2、TLR4、TLR9引物(上海英骏生物技术有限公司),Trizol试剂(Gibco公司),M-MLV逆转录酶和TaqDNA聚合酶(Promega公司)。二、方法1.基肥模型的制作20只大鼠随机分为模型组和正常对照组,每组10只。参照Hibi等报道的方法制备大鼠结肠炎模型。大鼠禁食24h,戊巴比妥钠30mg/kg腹腔麻醉,将聚乙烯导管插入结肠内距肛门口7~8cm处,以注射器注入100mg/kgTNBS+等体积无水乙醇灌肠,倒置30s,苏醒后正常饮食。正常对照组大鼠予等体积0.9%NaCl溶液灌肠。2.结肠黏膜损伤指数cmdi的测定造模后第2d起每天观察和评价大鼠体质量、腹泻和肉眼血便情况,于第10d计算疾病活动指数(DAI)以评估疾病活动度(见表1)。第10d处死大鼠,取肛门至回盲部肠段,沿肠系膜缘纵行剖开,于体示显微镜(解剖镜)下观察结肠大体形态,参照王皓等采用的大体损伤评分标准计算结肠黏膜损伤指数(CMDI)。每只大鼠于远端结肠、横结肠和升结肠各取一块约2mm×10mm的组织标本,另在严重炎症或溃疡处至少取一块组织标本,常规石蜡包埋、切片、HE染色,由病理科医师参照王皓等采用的组织学损伤评分标准观察、评分,结果取各部位标本评分的均值。3.黄系mpo活性测定按上文所述方法取结肠组织标本,以0.9%NaCl溶液(SOD)或匀浆介质(MPO)手工匀浆,制成1%(SOD)和5%(MPO)匀浆。以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性,以紫外分光光度法测定MPO活性,具体步骤参照试剂盒说明书。结果取各部位标本测定值的均值。4.酶标链霉亲和素混合物pbs采用SP法。各部位组织切片脱蜡、封闭、抗原热修复;滴加TLR2、TLR4和TLR9兔抗鼠多克隆一抗(稀释度均为1∶100);滴加二抗酶标链霉亲和素复合物;显色;复染;封片。每次检测均以0.01mol/LPBS代替一抗作为阴性对照。采用Image-ProPlus5.1图像分析软件(MediaCybernetics),以胞质和胞膜染成棕黄色为阳性细胞,每一样本随机选取5个高倍视野(×400),计数每平方毫米内阳性细胞数,以x±s表示。5.逆转录pcr检测总rna表达分别取50~100mg各部位结肠黏膜组织,捣碎,加入1mlTrizol溶液,匀浆;加入200μl氯仿,剧烈振荡15s,12000×g离心15min;取上清液0.5ml,加入异丙醇0.5ml,12000×g离心10min;弃上清液,加入750ml/L乙醇洗沉淀,晾干。取4μl总RNA行逆转录,取2μl逆转录产物行PCR扩增。各引物序列、退火温度和产物大小见表2。15g/L琼脂糖凝胶电泳,PCR产物以培清JS-300凝胶图像分析系统(上海培清科技有限公司)、OlympusDPController软件和Image-ProPlus5.1图像分析软件行光密度分析,目的基因mRNA的相对表达量以目的基因光密度值与内参照基因光密度值的比值表示。三、两组患者t检验和pearson相关分析应用SPSS13.0统计软件,计量资料以x±s表示,组间比较采用两独立样本t检验,各指标间相关性的分析采用Pearson相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。结果一、新时导致“争议”造模后1~2h大鼠即出现肉眼血便,1d后出现懒动、拱背、厌食、大便次数增多、软便或稀便,3d时达高峰,以后逐渐好转。造模10d后DAI较正常对照组显著升高(见表3)。二、各组小鼠cmdi的比较造模10d后,模型组结肠组织解剖镜下有不同程度的充血、水肿、糜烂、出血和浅小溃疡形成,以结肠下段为重,CMDI较正常对照组显著升高;光学显微镜下结肠组织中可见大量中性粒细胞、部分淋巴细胞和少量嗜酸性粒细胞浸润,累及黏膜下层和固有层,并可见隐窝脓肿和黏膜肌层增厚,组织学评分显著高于正常对照组(见表3)。三、sod和pmo的活性造模10d后,结肠组织SOD活性较正常对照组显著降低,MPO活性较正常对照组显著升高(见表3)。四、tlr9表达正常对照组结肠黏膜下层和固有层炎性细胞胞膜和胞质仅有少量TLR2、TLR4表达,未见TLR9表达;模型组黏膜下层和固有层TLR2、TLR4、TLR9的表达均较正常对照组显著增加,在一些CMDI和组织学评分较高的大鼠,还可见TLR2表达于肠上皮近肠腔侧胞膜,TLR4表达于肠上皮近肠腔侧胞膜和腺上皮近腺腔侧胞膜(见表4、图1)。五、mrna的表达TLR2、TLR4、TLR9mRNA在正常对照组结肠组织中均未见表达,模型组可见三者mRNA表达,相对表达量分别为1.99±0.34、2.10±0.38和1.30±0.25(见图2),均显著高于正常对照组(P<0.01)。六、tlr2表达对模型组和正常对照组各指标行Pearson相关分析,结果显示TLR2、TLR4、TLR9三者之间互呈正相关。TLR2的表达与CMDI、组织学评分、SOD活性和MPO活性有相关性;TLR4、TLR9的表达与DAI、CMDI、组织学评分、SOD活性和MPO活性有相关性。三者与CMDI、组织学评分和MPO活性呈正相关,与SOD活性呈负相关(见表5)。免疫组化检测IBD是一类非特异性炎性肠疾病,其发病机制尚不明确,动物模型的应用对于研究其发病机制具有重要意义。TNBS+乙醇诱导的结肠炎模型目前广泛应用于IBD的实验研究。TNBS是一种半抗原,以乙醇损伤肠黏膜屏障可增强机体对TNBS的免疫反应。本实验以TNBS+乙醇诱导的大鼠模型除有体质量减轻、腹泻、便血等临床症状外,还可见结肠组织充血、水肿、糜烂、出血、溃疡、大量炎性细胞浸润等组织病理学改变,DAI、CMDI和组织学评分均显著高于正常对照组,表明造模成功。TLRs的发现为研究免疫性疾病带来了新的契机。在哺乳动物对脂多糖(LPS)的反应中,TLR4可能是LPS更主要的信号转导受体,而TLR2可能参与其他病原体的识别,尤其是识别革兰阳性细菌和酵母菌受体;TLR9则参与对细菌DNACpG的介导。研究发现IBD时NF-κB表达升高,炎症介质过量表达,提示TLRs家族可能在IBD的发病机制中起有重要作用。正常人对肠道菌群耐受,而IBD患者则可能存在耐受缺失。本研究发现正常对照组结肠黏膜下层和固有层炎性细胞仅有少量TLR2、TLR4表达,而肠上皮则基本未见两者表达,推测与肠道的自身免疫耐受有关。模型组黏膜下层和固有层TLR2、TLR4的表达均显著增加,与国外报道一致,这可能会增强炎性细胞对LPS以及其他抗原的识别和呈递,使正常菌群被识别,从而打破自身免疫耐受,如免疫反应过强,可能造成肠道损伤。模型组一些CMDI和组织学评分较高的大鼠肠上皮也有TLR2、TLR4表达,甚至腺上皮也有TLR4表达,提示TLR2、TLR4表达越广泛、越强,肠道损伤越重。本研究还发现正常对照组结肠组织不表达TLR9,但模型组TLR9的表达显著增加,这可能会增强炎性细胞对肠道菌群CpG的识别,从而造成肠道损伤。SOD在机体的氧化与抗氧化平衡中起重要作用,SOD活力与炎症和自身免疫性疾病有密切关联,而MPO对中性粒细胞的吞噬等功能具有重要作用,组织MPO活性能反映中性粒细胞的浸润程度,两者均是评估肠道炎症的常用指标。本实验相关分析显示TLR2、TLR4、TLR9的表达与MPO、SOD以及CMDI、组织学评分有良好的相关性,进一步证实了三者与肠道损伤的对应关系。本实验中正常对照组RT-PCR未能扩增出明显的TLR2、TLR4条带,而免疫组化方法却见两者有少量表达。可能