黄牛鼻中透明质酸产生菌的分离与鉴定

黄牛鼻中透明质酸产生菌的分离与鉴定

h-1是由n-3-糖苷键和n-4-糖苷键组成的高等直觉酸，广泛存在于高等动物的结构体和一些细菌中。由于其溶液具有高粘性和独特的粘弹性而广泛应用于临床、诊断、化妆品等领域。透明质酸的生产方法主要有提取法和发酵法两种。由于组织提取成本较高、工艺复杂,因此应用更多的是以链球菌为发酵菌种的微生物发酵法。目前透明质酸的产生菌主要为链球菌A群和C群。其中链球菌A群具有人致病性,所以一般采用链球菌C群为发酵起始菌株。国外发酵法HA生产已达产业化阶段,但我国利用发酵法生产HA的技术仍不成熟,关键是没有高产HA的菌种。所以从自然界寻找HA高产菌株已成为发酵法生产HA的研究热点。作者从新鲜的水牛鼻粘膜分离筛选出15株菌株,经生化反应鉴定其中5株为透明质酸产生菌。对HA产量最高的菌株的发酵液精提物进行红外吸收光谱、核磁共振、紫外吸收光谱分析,并对其进行超声波/紫外线复合诱变,透明质酸产量大幅提高。1实验1.1材料表面新鲜水牛鼻粘膜,采自南京市江宁区某养牛专业户新宰杀水牛,共24份。1.2培养基(1)ph值的测定方法牛脑浸粉10.0g,牛心浸粉10.0g,胰蛋白胨10.0g,葡萄糖2.0g,NaCl5.0g,琼脂20.0g,加蒸馏水至1000mL,调pH值至7.0,121℃下灭菌20min。(2)血琼脂酸培养基将灭菌后的脑心浸液培养基冷却至50℃,在无菌条件下加入10%新鲜无菌脱纤维羊血后倒入平板冷却。(3)血清清髓细胞度测定葡萄糖10.0g,酵母膏10.0g,牛肉膏10.0g,MgSO4·7H2O2.0g,K2HPO42.0g,加蒸馏水至1000mL,调pH值至7.0,121℃下灭菌20min,冷却至常温,在无菌条件下加入10%小牛血清。(4)预处理葡萄糖10.0g,酵母膏20.0g,MgSO4·7H2O2.0g,K2HPO42.0g,加蒸馏水至1000mL,调pH值至7.0,121℃下灭菌20min。1.3细菌的分离与筛选1.3.1菌株在血培养基上的稳定性测定将新鲜的水牛鼻粘膜接入1%蛋白胨溶液中,36℃、150r·min-1下摇床培养12h。将培养液梯度稀释至不同浓度分别涂布于血琼脂平板上,36℃下培养24h。观察各菌落在血琼脂平板上的形态和溶血性,用接种针挑起看粘度。选取与文献描述类似的菌株,革兰氏染色镜检,并进行链球菌C群生化反应鉴定。1.3.2硫酸城市酸钠ha及其制备方法取初筛菌株1～2环,接入种子培养基中,36℃、200r·min-1下培养16h,转入发酵培养基中,继续在36℃、200r·min-1下培养48h,接种量为10%。发酵液经5000r·min-1离心10min,上清液加入2.5BV乙醇,沉淀完全,再次离心10min,取沉淀加入与起始发酵液等量的生理盐水溶解,稀释适当倍数后以硫酸咔唑法测定HA的产量。选取产量最高菌株的发酵液参照文献提纯,对发酵液精提物进行红外吸收光谱(IR)、核磁共振(13CNMR)、紫外吸收光谱(UV)分析,并对其进行诱变。1.4细菌的诱导1.4.1角瓶不同菌落的制备将细菌培养液在4000r·min-1下离心5min,倾去上清液,将菌体打散,加入无菌生理盐水洗涤数次,重新悬浮于10mL生理盐水中,摇匀后倒入装有玻璃珠的已灭菌三角瓶内,振荡20min。菌液过滤,单细胞滤液装入管内,作为待处理液。1.4.2紫外照射处理取10mL处理好的单细胞培养液用超声波破碎,在20kHz、200W、220V的超声条件下处理10min,梯度稀释,涂布于血琼脂平板上,暗培养24h。取其中菌落大、隆起高的菌落,再次制备单细胞培养液。取10mL单细胞培养液加入培养皿内,置于磁力搅拌器上紫外照射90s,紫外灯的功率为20W、照射距离为30cm。菌液梯度稀释,涂布于血琼脂平板上,暗培养24h。1.4.3透明质酸含量测定从血琼脂平板上挑菌落大、隆起高、溶血性较弱的菌株。选取1～2环接入装有种子培养基的摇瓶中,36℃、200r·min-1下培养16h,转入发酵培养基中,继续在36℃、200r·min-1下培养48h,接种量为10%,测定各菌株透明质酸的含量。选取HA产量较高的菌株,传代6次后重复以上操作,再次测定HA含量。2结果与讨论2.1革兰氏染色镜检及生化反应鉴定按1.3.1方法,选择血琼脂平板上圆而微凸、有光泽、用接种针挑起呈明显丝样粘连状的菌株进一步分离纯化,得到15株具有链球菌典型菌落特征的菌株。将其编号为A～O,进行革兰氏染色镜检及生化反应鉴定,结果见表1。适宜产HA的链球菌C群特征为β-溶血、革兰氏阳性菌、水解七叶苷、水解精氨酸、不水解明胶、不水解马尿酸盐。由镜检、溶血性、生化反应特征鉴定结果判断,菌株B、G、H、J、M符合链球菌C群的特征,进一步摇瓶复筛;菌株E、I非β-溶血,革兰氏染色阴性,为杂菌,弃去;其余菌株虽具有链球菌的菌落特征,但不符合链球菌C群的生化反应特征,虽可能产生透明质酸,但亦可能具有致病性,不宜作为发酵起始菌株,弃去。2.2细菌复验证2.2.1菌株产酸能力采用硫酸咔唑法测定菌株B、G、H、J、M的HA产量,结果如图1所示。从图1可以看出,菌株B产酸能力最强,为0.793g·L-1;其次是H和M,产酸量在0.65g·L-1左右;菌株J产HA能力最差,仅为0.305g·L-1。由于菌株B产HA能力最强,选择B作为诱变起始菌株,并对其发酵液精提物进行进一步鉴定。2.2.2缩裂振动特征吸收峰的鉴定用KBr压片法制备样品,扫描范围为4000～700cm-1。菌株B发酵液精提物红外吸收光谱图如图2所示。从图2可以看出,菌株B发酵液精提物在3400cm-1处出现强烈的-OH的伸缩振动特征吸收峰,表明有多羟基结构;在2920cm-1附近有-CH2、-CH或-CH3的伸缩振动特征吸收峰;在1620cm-1、1560cm-1处有-C=O、-C-N的伸缩振动特征吸收峰,表明存在乙酰氨基结构;在1400～1320cm-1处有-COO中-C-O的伸缩振动和-OH的弯曲振动耦合产生的2个吸收峰,表明存在解离羧基结构和多糖羟基结构的糖醛酸。发酵液精提物与HA标准品红外吸收图谱基本一致。2.2.3侧基上-ch3的特征峰对菌株B发酵液精提物进行核磁共振分析,频率为300MHz,扫描温度为313K,控温误差为±0.1℃。结果如图3所示。从图3可以看出,在δ177.51及δ176.61处出现-COO-及=CO的特征峰;在δ105.80和δ103.15处出现-O(O)CH-的特征峰;在δ71.17～δ85.49处出现一系列=CHOH的特征峰;在δ56.93处出现=CHNH的特征峰;在δ60.25处出现侧基-CH2OH的特征峰;在δ25.11处出现侧基上-CH3的特征峰。由菌株B发酵液精提物与HA标准品的13CNMR图谱对比可知,两者结构基本一致。2.2.4紫外吸收波长的测定对菌株B发酵液精提物的溶液与HA标准品溶液分别在190～280nm范围内进行紫外扫描,测定其最大紫外吸收波长,结果见图4。从图4可以看出,菌株B发酵液精提物最大吸收波长为205nm,与HA标准品相同,且两者的峰型一致。2.3超声波和紫外表面活性剂的结合2.3.1紫外线复合诱变法从图5可以看出,经物理诱变(超声波/紫外线复合诱变)处理后,部分菌落明显变大,隆起变高,呈粘连状,且溶血性明显变弱,表明适宜作为发酵菌株。2.3.2发酵菌株ha产量测定采用超声波/紫外线复合诱变菌株B,选择5株菌落大、隆起高、溶血性弱的菌株,分别编号为B1～B5,发酵后测定HA产量,结果见表2。从表2可以看出,菌株B3的HA产量最高。选择菌株B3,传代6次,摇瓶发酵测定其HA产量,