植物生长调节剂芦荟生肌膏精提液对内毒素刺激的成纤维细胞增殖的影响

植物生长调节剂芦荟生肌膏精提液对内毒素刺激的成纤维细胞增殖的影响

由于位置的特殊性，肛门直肠疾病患者术后肉芽组织生长缓慢，愈合时间长。以最常见的肛门直肠疾病为例，大多数需要1.5-2个月才能治愈。能否加速创面肉芽组织增生和瘢痕形成一直是临床研究的重点。根据现代医学理论,成纤维细胞是创面愈合过程中最主要的修复细胞,在多种因素的作用下合成胶原纤维,在肉芽组织的形成过程中,起关键性作用。而细菌及细菌释放内毒素的作用是引起创面愈合延缓的主要因素,导致创面肉芽水肿,减少成纤维细胞增生及向胶原纤维转化过程。在目前肛管直肠疾病创面的用药方面,临床应用表皮生长因子等药物效果也不理想。因此,我们根据中医药学理论,通过成纤维细胞培养的方法筛选出芦荟生肌膏组方,取得较满意的效果。1材料和方法1.1血清因子的检测L929小鼠成纤维细胞株:购自北京百和营生物科技有限公司,接种于含10%小牛血清,1×105μ/L青霉素,100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基(pH7.2)中,于37℃,5%CO2培养箱中培养。1.2mtt状的检测RPMI-1640基础培养(GIBCO),0.25%胰蛋白酶(华美生物工程公司),四氮甲唑蓝(MTT)及内毒素(LPS)(美国sigma公司产品)。1.3仪器、仪器和仪器荧光倒置显微镜(德国莱卡),酶标仪318MC型(上海三科仪器有限公司),高速冷冻离心机3D30型(美国SIGMA),二氧化碳孵箱(美国Thermo)。1.4样品中单味中药的制备中药采用水煎法,先加6倍蒸馏水,浸泡1h,煎煮(按沸后开始记时)40min,煎液过滤,药渣再加6倍蒸馏水继续煎煮40min,两次煎液合并,减压浓缩至浓度为2g/mL,离心20min后取上清液,高压灭菌后调整pH在7.2左右,4℃保存备用。芦荟、当归、白芷、紫草、大黄、黄连等单味中药按相同方法和浓度提取。应用前加入基础培养液中,稀释成不同浓度。1.5方法1.5.1两组不同浓度血清的两组将生长状态良好的L929细胞以0.25%胰酶(pH为7.2)消化,用RP-MI-1640基础培养基洗细胞两次(1500r/min,8-10min),用含10%小牛血清的1640培养基重悬,调节细胞数为2×104/mL,铺于24孔平底板中置于37℃,5%CO2孵箱中孵育24h后换成无血清培养基继续培养24h,使细胞同步化至G1期,然后随机分组,其中对照组:加含血清的1640培养基,每孔加入的总量为100μL每组6个复孔。LPS刺激组,加含有LPS的含血清的1640培养基,使LPS终浓度为100mg/L;给药组,在LPS刺激12h后,分别加入芦荟生肌膏精提液,终浓度分别为0.5g/mL、0.25g/mL、0.1g/mL。作用24h后,每孔加入MTT100μL,于微型振荡器上振荡3-5min,酶标仪上读取570nm处OD值,以对照组的OD值减去给药组的OD值再比上对照组的OD值为抑制率。1.5.2显微镜人类学将上述各组细胞置显微镜下,在中倍镜下照相。1.6统计处理数据以表示,统计资料采用SPSS12.0统计软件包处理,多组样本间采取One-WayANOVA分析,样本率的比较采用χ2检验。2结果2.1中药精制提取液对lps增殖的影响从表1可见LPS可以显著抑制成纤维细胞的增殖,而加入不同浓度中药精制提取液后,可以不同程度地减轻LPS的抑制作用,成纤维细胞的增殖恢复,其中以大剂量最为明显。2.2lps刺激组和对照组细胞生长和细胞间间距分布细胞同步化至G1期后,随机分5组,36h后显微镜下观察成纤维细胞生长情况并拍照。其中,与对照组相比较(图1),LPS刺激组在LPS作用36h后,细胞生长受到抑制明显,细胞间间距较大,较为稀疏,细胞拉长(图2);与小剂量(图3)、中剂量组(图4)相比,大剂量组在LPS刺激12h后,细胞生长明显恢复,表现为基本融合成片,呈梭形(图5)。2.3生长、形态⑴内毒素(LPS)可以显著抑制体外成纤维细胞的增殖,镜下表现为细胞稀疏,生长减慢,细胞形态拉长。⑵芦荟生肌膏精提液对LPS刺激的成纤维细胞增殖有保护作用,可以拮抗LPS的抑制作用,恢复成纤维细胞的增殖,提示芦荟生肌膏可以通过促进成纤维细胞的增殖而促进直肠创面组织的愈合。3调节脏器内毒素细菌内毒素又称脂多糖(LPS),它与蛋白质、磷脂等共同构成革兰氏阴性细菌的外膜。LPS是一个由多糖和类脂A(LipidA)构成的生物大分子,整个分子的基本结构由3部分共价连接而成,即O-特异性抗原多糖、核心多糖、LipidA。其中LipidA是LPS中最保守的部分,是LPS的毒性和生物活性中心。LPS的作用相当复杂,除致热性外,可以干扰细胞能量代谢,造成失控性炎症,细胞凋亡。成纤维细胞参与创伤愈合全过程,是创伤愈合中主要的修复细胞之一,在创伤愈合过程中起到重要作用。由于直肠创面的特殊性,易被大便污染和肠道革兰氏阴性细菌感染,从而使细菌及细菌释放大量内毒素成为引起肛门创面愈合延缓的主要因素。已有研究证实高浓度的内毒素脂多糖可抑制成纤维细胞生长。本实验结果表明LPS使成纤维细胞的细胞数量、幼稚细胞、分裂相减少并使细胞变性、坏死,可见LPS抑制成纤维细胞的增殖并对成纤维细胞有直接的毒性作用,并可以从间接反映细胞数量的MTT值的抑制率和从显微镜下细胞数量的变化上得到了证实。过高浓度的LPS抑制成纤维细胞增殖可能与其对细胞DNA合成的抑制有关,并且LPS抑制了成纤维细胞的有丝分裂,使成纤维细胞处于G1期,无法进入S期,并干扰其能量代谢,甚至造成细胞凋亡。虽然目前创伤修复研究在分子生物学、基因组学、遗传学以及网络调控等方面有所突破,生长因子等也逐步应用于临床,但是还存在诸多问题,离临床应用特别是肛门直肠创面愈合还是有一定差距。芦荟生肌膏为临床肛门直肠创面愈合治疗提供了一种新的治疗手段。芦荟生肌膏精提液,以芦荟为主药,并加入当归、白芷、紫草、大黄、黄连等中药精炼提取制成。祖国医学认为,芦荟,味苦,性寒,归肝、胃、大肠经,有泻下、清肝、杀虫、止血、疗伤等功效。同时当归、白芷、紫草、大黄、黄连等有活血化瘀、清热解毒、化腐生肌等作用。现代药理实验研究证明,芦荟对多种细菌有抑制作用,具有较显著的抑制内毒素作用,芦荟多糖、微量元素能等促进成纤维细胞生长。崔栀等研究证明芦荟具有较显著的抑制内毒紊的作用,并通过显色基质法定量检测内毒紊被抑制的百分率在一定范围内随药物浓度的增加而升高。Pribitkin等发现芦荟凝胶不仅可增强胶原蛋白之间的交联活性,以提高其抗张强度,并有加速伤口收缩、中和抗菌药