常用细胞培养技术 细胞原代培养

细胞原代培养2023/10/2712023/10/2722023/10/27凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。22023/10/2732023/10/27125一、培养室的无菌操作1、培养前准备制订实验计划、操作程序、实验数据；准备：器材、物品置于超净台；（细胞、培养液）各种物品75%酒精擦拭后，再放入超净台。2、超净台消毒紫外线照射30min,细胞和培养液不能照射；物品排放整齐，不要过多重叠，否则效果降低；实验前75%酒精擦拭台面；32023/10/2742023/10/271253、防护戴手套，75%酒精/0.2%新洁尔灭消毒手和手臂；戴口罩，不允许讲话（支原体）；有条件，白大褂、帽子.4、无菌操作操作前，过酒精灯火焰消毒，冷却后使用；瓶口、瓶盖、移液管、胶塞、镊子等手不能拿出超净台，否则重新擦拭。42023/10/2752023/10/27125台面物品摆放有序，左手：右手，酒精灯居中；移液管/枪头不能交叉使用；移液管等不能触及瓶口、皿口等；瓶口倾斜，瓶盖竖放，皿盖半开，防止细菌落入；吸管口向下倾斜，防止液体倒流。不能在开启容器上方操作。在超净台中央无菌区域操作。枪头盒用后盖上。火焰附近操作。2023/10/2762023/10/27125•取材是原代细胞培养成功的首要条件，直接影响细胞的体外培养。取材基本要求1．取材要注意新鲜，否则1cm3、4℃保存，24hr内使用2．严格无菌3．防止机械损伤→锋利刀片切割4．去除无用组织（血液、脂肪、结缔、坏死组织），避免干燥5．记录：组织类型、分化程度、年龄等，留好样本二、原代细胞的取材2023/10/2772023/10/276.原代培养，需营养丰富（10%-20%胎牛血清，进口）7.各种组织培养的难易程度胚胎组织较成熟个体组织易培养分化低的较分化高的组织易培养肿瘤组织较正常组织易培养2023/10/2782023/10/27各类组织的取材技术皮肤和粘膜的取材内脏和实体瘤的取材血液细胞的取材骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材动物组织取材人胚体组织取材鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材2023/10/2792023/10/27皮肤和粘膜的取材上皮细胞培养来源：来源：主要取自于手术过程中的皮片；消毒：体表微生物多，严格消毒，不能用碘酒=〉影响细胞生长；面积一般2-4mm2；不要太厚，尽量去除皮下和粘膜下组织。2023/10/27102023/10/27内脏和实体瘤的取材内脏除消化道外基本是无菌的；明确、熟悉所需组织的类型和部位；实体瘤：取肿瘤细胞丰富区域；要避开破溃、坏死液化部分，以防污染；尽量去除混杂的血管、神经和结缔组织。2023/10/27112023/10/27血液细胞的取材血细胞：一般多抽取静脉血淋巴细胞：从淋巴组织中（如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等）分离细胞；取材时应抗凝（肝素）常用浓度20U/mL针筒用500U/mL肝素润湿。2023/10/27122023/10/27骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材严格无菌；离心PBS洗两次培养液洗一次，培养。2023/10/27132023/10/27鼠胚组织取材引颈或气管窒息法处死孕期鼠；75%酒精浸泡5分钟（时间不能长，否则酒精从口或其他通道进入体内，影响组织活力）；无菌图钉固定四肢在消毒木板上；切开皮肤，无菌取胚或无菌止血钳挟起皮肤、沿躯干中部环形剪开皮肤，挟住两侧皮肤拉向头尾，把动物反包，暴露躯干，取出胚胎。2023/10/27142023/10/27鼠胚肾（或肺）取材幼鼠采用上述方法处死消毒后，腹部/背部朝上固定在木板上；腹部朝上，无菌打开胸腔取肺。或背部朝上，无菌取肾。2023/10/27152023/10/27鸡（鸭）鸟类胚胎组织取材取孵化9-12天的胚蛋；灯检有丰富血管、胚体运动的胚蛋，划出气室和胚体位置；用温水清洗蛋壳，再用75%酒精棉球擦干；无菌打开气室，沿气室边缘去除蛋壳；无菌取出鸡胚。2023/10/27162023/10/27（一）悬浮细胞的分离方法组织材料：血液、羊水、胸水或腹水；方法：采用1000r/min的低速离心10分钟。离心后各种比重不同的细胞在分层液中分层，这样可根据需要收获目的细胞。注意：速度不能过高，时间不能过长，以免挤压细胞，引起损伤和死亡。三、组织材料的分离2023/10/27172023/10/27（二）实体组织材料（组织块）的分离方法实体组织材料，细胞间结合紧密组织细胞充分分散，形成细胞悬液机械分散法（物理裂解）消化分离法。2023/10/27182023/10/27机械分散法适用对象：纤维成分很少的组织脑组织、胚胎组织及一些肿瘤组织；方法:剪切后，吸管反复吸打组织通过注射器针头---细胞损伤大。注射器芯挤压通过不锈钢网筛---常用。特点:简便、快速对组织机械损伤大细胞分散效果差。2023/10/27192023/10/27剪切法10mm3小块休整、冲洗反复剪切至糊状加入Hank’s液/无血清培养液反复吹打离心去上清组织小块用于培养2023/10/27202023/10/272023/10/27212023/10/27消化分离法组织剪切成较小团块（或糊状）；进一步使细胞间的桥连结构松动使团块膨松使细胞团块充分分散；接种培养，细胞容易贴壁生长。

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酶的生化作用

非酶的化学作用少量细胞团和大量单个细胞的悬液2023/10/27222023/10/27方法

1-2mm3小块，3-5倍体积胰蛋白酶搅拌（慢）消化20-60min（30）若时间长，取2/3上清/15min,离心收细胞加入新胰酶继续消化过100目网筛离心、漂洗、计数、稀释、接种培养（0.5Χ106～1Χ106）2023/10/27232023/10/27消化分离法的注意事项组织块漂洗：2-3次除去组织中的钙、镁离子和血清。防止抑制胰蛋白酶和EDTA的作用。胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。消化后组织漂洗，避免毒性产生。动作要轻，避免膨松的细胞随漂洗而丢失。2023/10/27242023/10/27计数板的认识两个计数室每个：长3mm;宽3mm;高0.1mm=0.9mm3一个大方格=0.1mm31×10-4ml(4大格细胞数之和/4)x1041ml悬液中细胞数2023/10/27252023/10/27计数方法准备：计数板、盖玻片：酒精清洁，干燥；制备细胞悬液：单细胞，密度〉104个/mL；加样：盖玻片放于计数板中央吸少量悬液，从盖玻片一侧加入，不要溢出，不要过少，不要有气泡。计数:四角大方格总数压线细胞：计上不计下，计左不计右2023/10/27262023/10/27125计算

细胞数/毫升原液=（4大格细胞数和/4）x104x稀释倍数注意细胞分散良好出现较多细胞团细胞数少于20个/1mm2细胞数多于50个/1mm2重制细胞悬液，重新计数。

每次吸取前要混匀计数时，遇细胞团，按单个细胞计算；262023/10/2727细胞密度换算溶液稀释公式C1xV1=C2xV2C1、V1表示稀释前的浓度和体积C2、V2表示稀释后的浓度和体积例：现有108/ml悬液，配制106/ml悬液10mL，如何配制？

108xV1=106x10V1=107/108=0.1毫升即取原液0.1毫升，加9.9毫升培养基，混匀。2023/10/272023/10/27282023/10/27四、接种培养2023/10/27292023/10/27（一）组织块培养法特点常用、简便易行、成功率较高；培养时间长不是每一组织块都能长出细胞。瓶壁可预先涂以胶原薄层，利于组织块粘着瓶壁，周边细胞能沿瓶壁向外生长。2023/10/27302023/10/27125具体步骤剪1mm3小块，剪切时保持湿润；小块均匀摆放，间隔0.5cm；轻轻反转培养瓶，底朝上，加入适量培养液，37度静置2-4hr；待组织块贴敷后，翻转培养瓶，静置培养；注意事项翻转时动作轻，防冲起；观察：污染及时清除；3~5天换液，去除组织块、血细胞及细胞碎片。2023/10/27312023/10/27125312-4hr2023/10/27322023/10/27125注意：随时镜检，分散成单个细胞或细胞团停止消化32（二）消化培养法2023/10/27332023/10/27（三）悬浮细胞培养法对于悬浮生长的细胞如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化；低速离心分离，直接培养或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。2023/10/27342023/10/27（四）器官培养

指从供体取得器官或器官组织块后，直接在体外特定环境条件下培养；要求:保持器官的相对完整性；目的：观察细胞间的联系、排列情况、相互影响，以及局部环境的生物调节作用。2023/10/27352023/10/27注意防止器官中心坏死；所以保证氧的供给；组织块厚度或直径不易超过1mm；组织块不能完全浸入培养液；2023/10/27362023/10/27方法凝固的血浆基质培养法平皿表面有一层凝固的鸡血浆/鸡胚浸出液缺点：组织周围的血浆凝块发生浸润，器官陷入培养基。琼脂基质培养法血浆、鸡胚浸出液和灭菌琼脂混合，形成稳定的半固体培养基，进行表面培养。弥补方法1的不足2023/10/27372023/10/27漂浮法擦镜纸打孔/醋酸纤维素薄膜/微孔滤膜上放置器官培养。格栅培养法

漂浮的薄膜有时会下沉，引入金属格栅，组织块放在金属格栅上，培养液与格栅奇平。交替暴露于培养基和气相培养法2023/10/27382023/10/27原代培养要求（贴壁细胞）充分漂洗，尽量除去消化液的毒性；接种时浓度要稍大一些；血清浓度高一