快速检测牛奶中氯霉素残留的方法

快速检测牛奶中氯霉素残留的方法

氯霉素（cap）是一种有效的光谱抗生素，对各种疾病都有很强的抑制作用。这曾经是中国常见的抗菌药物之一。然而，氯霉素有严重的毒副作用，可能会导致人类的再生障碍贫血、颗粒细胞贫血、新生儿优先性灰烬综合征、新生儿、早产儿灰烬综合征等。中国农业部禁止使用这种药物。无论出于何种原因，氯仿残留都是一个必要的项目。然而，中国一些农户使用氯霉素治疗鸟类和牛病，对人类健康构成了重大威胁。为了确保人民的健康，扩大与世界各国的食品贸易往来，我们必须建立灵活、特异性强、简单、快速的测定方法，并监控喂食中氯霉素的残留。目前,关于氯霉素的检测方法国外文献报道的主要有酶免疫法、放射免疫法、高效液相色谱法、气相色谱法和微生物法.酶免疫法具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点,现已有试剂盒供应市场,可以直接用于生产实践,但若用于大规模检测则成本太高.放射免疫法因使用放射性物质,给操作过程带来诸多不便,已不再使用.高效液相色谱法虽然操作简单,但最低检测限较高,无法满足当前对氯霉素低残留限量的检测要求.气相色谱法灵敏度较高,但样品前处理过程复杂、分析速度慢、仪器化程度高且价格昂贵,不适合在基层推广使用.常用的微生物检测法包括试纸法、棉签法、发酵法等,笔者实验结果表明,快速检测试纸法具有简单、快速、重复性较好等特点,适用于大量样品的残留检测.1设备和材料1.1仪器、药品和仪器AB204-N电子秤(Mettler-toledoGroup),LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂),超净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司HX-840),定量取样枪(eppendorf),快速混匀器(国华电器有限公司),生化培养箱(国华电器有限公司).1.2主要试剂和仪器氯霉素快速检测试纸(大连普瑞康生物技术公司),氯霉素标准品(美国SIGMA公司,含量不低于99.0%),牛肉膏(中国医药集团上海化学试剂公司),胰蛋白胨(中国医药集团上海化学试剂公司),酵母膏(北京奥博星生物技术责任有限公司),葡萄糖(北京奥博星生物技术责任有限公司),琼脂粉(青岛冻粉厂),pH试纸(pH5.5～9.0),NaOH(北京化学试剂公司),乳杆菌(宁厦大学生命科学学院许崇波老师惠赠),嗜热链球菌(解放军军需大学分子细菌学研究室惠赠),短小芽孢杆菌(笔者所在研究室保存).1.3实验材料2实验方法2.1快速检测试卷法2.1.1氯霉素指示剂用量的确定将样品及反应孔做好对应编号.以小吸管在微量测试孔中依次加入2滴待测的样品(用小吸管吸取时,须将第1滴滴除,以防对结果的干扰).充分摇匀氯霉素指示剂,以新的滴管吸取氯霉素指示剂,滴去前2滴,加入1滴指示剂于待测样品的测试孔.以手轻轻握住微孔,贴着桌面震荡约5min使其混合均匀.在每个测试孔中放入试纸片(白色端在下),静置10min后判读结果(不要超过20min).2.1.2氯霉素质量浓度C线(对照线)在上,T线(测试线)在下,如果T线比C线深,或一样深,呈阴性反应,表示样品中氯霉素质量浓度低于3μg/L;如果T线比C线淡,呈阳性反应,表示样品中氯霉素质量浓度高于3μg/L,氯霉素质量浓度越高T线越淡;如果C线完全没出现,则表示测试失败.测试结果见表1.2.1.3氯霉素检测精确配制0,1,2,3,4,5μg/L的氯霉素标准液,用快速检测试纸进行检测.结果表明,ρ(氯霉素)≥3μg/L时,T线均比C线淡,有较高的准确性.用以上的氯霉素标准液每样做3个重复(在1d内检测3次),7d内选择3天进行检测.在ρ(氯霉素)为4,5μg/L时,T线均比C线淡;ρ(氯霉素)为3μg/L时,批内变异系数≤16%、批间变异系数≤21%,证明氯霉素快速检测试纸有较高的准确性和重复性.2.2调整ph精确配制0,1.5,2.0,4.5mg/L的氯霉素溶液,编号为1～4.称取10g胰蛋白胨、1.5g牛肉膏、3g酵母膏、1g葡萄糖、17g琼脂、1L水,调整pH7.8～8.0;配制培养基,倒平板,涂布接种高浓度短小芽孢杆菌,分别用棉签蘸取4份奶样(编号为5～8)及氯霉素溶液放置于涂满短小芽孢杆菌的培养基中,37℃恒温培养过夜,观察是否在棉签周围出现边缘整齐的抑菌环,若有,则表明该液样中有氯霉素存在.测定结果见表2.2.3牛奶中含有氯霉素的测定分别向三角瓶中加入100mL奶样,先加热至沸腾,再冷却至42℃.以3%接种量接种乳杆菌及嗜热链球菌,振荡混匀,置于42℃恒温箱中培养3h.分别移取10mL奶样,加入0.5mL酚酞、20mL自来水,用0.1mol/L?NaOH滴定至变色.根据NaOH消耗量来确定牛奶中是否含有氯霉素,如果所消耗NaOH量小于50mL,则表明奶样中含有氯霉素.测定结果见表3.3结果与讨论3.1结果10份鲜奶中有1份T线比C线淡,呈阳性;其他方法检测结果也表明该奶样中含有氯霉素,证明试纸法有较高的准确性、适用性、可行性.3.2分析与讨论3.2.1传统微生物法三生物强化氯霉素快速检测试纸需要干燥保存.试剂瓶要随时确保盖严,并放于4℃冰箱中留待下次再用.测试环境温度需高于20℃,且测试前需先将整套组成部分在室温中回温30min,以确保反应的准确性.确保整套组成部分不受污染.传统的微生物法除棉签法、发酵法外还有杯碟法、拭子法等,但所有传统微生物法均存在一问题,即容易出现假阳性,因此,如使用此类方法,须采用专属性菌种或在样品前处理过程中加入青霉素、土霉素等抗生素以消除干扰影响.此外,一般的棉签法实验所得抑菌环不明显,边缘模糊.笔者实验采用短小芽孢杆菌以及在培养基中加入少量葡萄糖,可以使抑菌环有较高的清晰度,而且边缘整齐,能较准确地判断氯霉素的有无.3.2.2检测方法的确定在实际工作中,不可能也无必要对所有动物性食品进行各种复杂、昂贵、耗时的分析检测,为能快速确定动物性食品中是否有氯霉素残留,一般做法是遵循一定程序,按规范要求对被测产品进行取样、筛选检测,对筛选检测为阳性的样品再用更精确的方法进行定量鉴定.棉签法和发酵法费用小,但耗时长(棉签法至少需要3d,发酵法需要5h);它们受操作过程和实验环境的影响较大,变异系数较高,结果不准确;它们的最低检测限较高,容易造成氯霉素的漏检,只适用于氯霉素残留的定性检测.快速检测试纸法检测牛奶中氯霉素残留,整个操作过程只须15min,能在几小时内检测几百至上千个样品;不需要复杂的仪