中药莪术对小鼠黑色素瘤高转移细胞b16-bl6转移相关能力的影响

中药莪术对小鼠黑色素瘤高转移细胞b16-bl6转移相关能力的影响

转移和转移是肿瘤最显著的生物学特征，也是临床癌症患者死亡的主要原因。因此阻止肿瘤的侵袭和转移是恶性肿瘤治疗成败的关键因素。莪术的抗肿瘤活性物质主要为榄香烯、莪术酮、莪术二酮、莪术醇、异莪术醇等。但是作为临床上传统的活血化瘀用药,它究竟能抑制还是促进肿瘤的侵袭转移,医学界说法不一,相关的实验研究也很少。本文采用体内、体外实验方法研究了莪术对B16-BL6细胞侵袭、粘附、运动和转移能力的影响。1材料和方法1.1dmem溶液莪术生药浸泡于药量10倍的水中1h,然后文火煎煮2h,滤出上清后再加8倍量水煎煮1h,合并两次上清液,静置,3000rpm离心15min。上清在水浴上浓缩为1g/ml的贮存液,置4℃保存。实验前,用DMEM培养液(不含血清)稀释成所需浓度,过滤灭菌,用于体外实验;或者用蒸馏水直接稀释为所需浓度进行体内实验。1.2血清氨基酸和养血剂DMEM培养基,Gibco公司;新生牛血清(FCS),杭州四季青;活细胞计数试剂盒(cck-8),株式会社日本同仁化学研究所;牛血清白蛋白(BSA)、噻唑蓝(MTT),AMRESCO公司;纤维粘连蛋白(FN)、Matrigel(EHS肉瘤中提取的基质成分),北京大学医学部细胞研究室提供;层粘连蛋白(LN),Sigma公司;优凯特胶(Eukitt),Fluka公司;Transwell小室,Costar公司;无吡咯烷酮的聚碳酸酯膜PVPF(孔径8.0μm、直径13mm),Whatman公司。1.3b16-bl6细胞的培养小鼠黑色素瘤高转移细胞株B16-BL6由南京师范大学分子与医学实验室李朝军教授赠送,自行传代保存。B16-BL6细胞在37℃和5%CO2条件下,培养于含10%新生牛血清的DMEM培养液中。C57BL/6小鼠,雄性,6~8周龄,体重(20±2)g,由上海斯莱克实验动物有限公司提供(SCXK<沪>2003-0003)。1.4方法1.4.1含药培养液制备BL6细胞的增殖抑制实验取对数生长期的B16-BL6细胞,0.25%胰蛋白酶消化,离心收集细胞,用培养基稀释成5×104/ml,加入96孔板中,每孔100μl,每个样品点6个复孔。培养24h后,换液,每孔加入含药培养液100μl(莪术终浓度为30、25、20、10、5mg/ml,临用时用培养液将贮存液稀释配置),对照孔直接加入100μl培养液。37℃培养48h后,每孔加入10μlcck-8试剂,再培养2h,直接于酶标仪(SPECTRAMAX190)上测量波长450nm处OD值,实验重复2次。1.4.2重组基底膜的制备将LN2μg铺于96孔板,室温过夜干燥后,用含2%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液20μl37℃封闭1h后,PBS洗3次,每孔加入8×104个预先经药物作用48h的B16-BL6细胞,培养1.5h后,PBS轻轻吹打2次,洗去未粘附的细胞,每孔加入20μlMTT(2mg/ml),于细胞培养箱中继续培养4h,弃上清,每孔加入100μlDMSO溶液,振荡混匀后,于酶标仪上测定570nm处OD值,实验重复2次。1.4.3B16-BL6细胞侵袭重组基底膜实验将PVPF滤膜贴于Transwell小室中,滤膜的外表面涂FN5μg,内表面涂Matrigel10μg,室温过夜干燥,形成一个基质屏障层。用0.25%胰蛋白酶消化预先经药物处理48h的B16-BL6细胞,以2×106/ml密度重新悬浮于含0.1%BSA的DMEM无血清培养基中,取100μl上述细胞悬液加入Transwell小室中。将小室置于24孔板中加入600μl含0.1%BSA的DMEM无血清培养基,37℃孵育4h后,取滤膜用甲醇中固定,苏木精及伊红染色,擦去Matrigel一侧未穿过膜的细胞,Eulitt胶封膜,400倍光学显微镜下计数膜上下左右中5个不同视野侵袭细胞数,计算平均值,实验重复2次。1.4.4p16-b6运动测试1.4.5给药、大鼠荷瘤侧培养参照文献复制模型并进行实验。接种瘤液次日将动物随机分组,以等体积(0.4ml)不同浓度口服灌胃给药,对照组给予等体积生理盐水溶液,连续给药35天,一天一次。接种瘤液后约3周(对照组瘤体≥10mm3)时,在0.6%戊巴比妥钠麻醉下高位截除小鼠荷瘤侧后肢。对截下的原发灶后肢称重,并计算抑瘤率。继续给药约2周,处死动物,解剖取肺,用10%甲醛溶液固定。在解剖显微镜下计数肺组织表面肿瘤结节数,比较各组动物肺转移灶数目及大小。2结果2.1对照组平均od值对细胞生长的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。莪术水提液浓度为30、25mg/ml时能显著抑制细胞增殖,抑制率分别为7.9%、13.7%,故在以后实验中采用20、10、5mg/ml三个浓度。2.2平均od值的计算按下式计算药物对细胞粘附的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100%。莪术水提液在20mg/ml浓度时能显著抑制B16-BL6细胞与LN的粘附,相对抑制率为8.3%,见表1。2.3平均侵蚀细胞数按下式计算药物对细胞侵袭的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100%。莪术水提液在浓度为10mg/ml时能显著抑制B16-BL6细胞侵袭基底膜的能力,其抑制率为12.6%,见表2。2.4平均运动细胞数/对照组运动细胞数运动能力数100%按下式计算药物对细胞运动能力的抑制率(IR):IR(%)=(1-实验组平均运动细胞数/对照组平均运动细胞数)×100%。莪术水提液在浓度为10mg/ml时能显著抑制B16-BL6细胞穿越基底膜的运动能力,抑制率为12.9%,见表2。2.5对原发灶及转移灶生长的影响按下式计算抑瘤率:抑瘤率(%)=(1-实验组平均原发灶后肢重/对照组平均原发灶后肢重)×100%。高剂量莪术水提液能显著抑制移植瘤原发灶及转移灶的生长,见表3。卡方检验显示莪术高剂量组小鼠的肺表面结节数比对照组显著减少,见表4,结节明显减小,肺转移程度减轻,见表5。3血管内皮功能莪术的抗肿瘤作用已经被实验和临床研究所证实,其分子作用机理也基本揭示。本实验再次从体内、外确证了莪术的抗肿瘤作用,但可能因为莪术的抗肿瘤有效成分主要存在于莪术油中,本实验莪术水提液浓度较高时才表现出抗肿瘤活性。中医认为肿瘤转移的病机主要包括气滞血瘀、痰凝毒聚等方面,如有认为瘀血内阻(类似于现代医学的血液高凝状态)是癌复发、转移的重要因素,活血化瘀药物对防止复发转移具有重要意义。但也有实验发现活血化瘀中药会促进肿瘤的转移,甚至有研究者认为活血化瘀作用力度与促肿瘤转移的倾向存在正相关的关系。也曾有人提出肿瘤治疗忌破血,破血之药能使瘀毒在脉络中随波逐澜,应用过久,每易导致肿瘤扩散或转移,预后不良。但是具有破血作用的莪术作为传统活血化瘀中药,莪术的抗肿瘤转移的实验研究不多,丁荣杰等发现三棱、莪术可能通过促进模型大鼠VEGF的表达而促进肝癌的生长、转移,但在配伍后则具有抗肿瘤生长的作用。恶性肿瘤细胞的转移是一个多步骤的复杂过程,粘附是肿瘤细胞侵袭的始动步骤。肿瘤细胞通过膜表面受体粘附于基底膜及胞外基质成分如FN和LN等。高侵袭的肿瘤细胞与基底膜成分的粘附能力通常增高,这样有利于肿瘤细胞与肿瘤母体分离。另外,在肿瘤转移形成过程中,肿瘤细胞侵袭基底膜以及向趋化剂运动也是重要的环节。阻断肿瘤细胞粘附、侵袭和运动过程的各个环节均有可能抑制肿瘤的转移。B16-BL6小鼠黑色素瘤自发性转移模型是将具有高转移能力的B16-BL6细胞移植于动物局部,瘤体增殖生长后,侵袭周围正常组织和血管,进入血循环,到达远处部位发生肿瘤转移,可反映出肿瘤细胞侵袭、血行散播、侵袭的完整转移过程。本实验结果表明,莪术水提液能抑制肿瘤细胞的体外粘附、侵袭和运动,也能抑制黑色素瘤的在体转移。莪术作为活血化瘀作用力度较强的破血药,理论上临床作用剂量应低些,但如果抗转移的有效成分与抗肿瘤生长的有效成分一样存在与莪术挥发油中,而在中药的煎煮过程中会损失部分挥