石油降解菌的筛选及其对大庆油田的原位修复研究

石油降解菌的筛选及其对大庆油田的原位修复研究

石油污染土壤的生物恢复包括将污染物降解、积累并转移到生物废物中以恢复土壤生态功能的过程。恢复方法包括微生物作用、植物作用和两者的结合。目前,国内关于石油污染土壤的生物修复技术大多还仅限于实验室研究阶段,研究内容主要是利用微生物对石油污染土壤进行修复,利用微生物与植物进行联合修复的研究还少见报道。本工作采用微生物和植物对石油污染土壤进行了联合修复,研究了在较大规模条件下石油污染物的降解规律,为大范围修复石油污染土壤提供了依据。1实验部分1.1培养基和生长剂无机培养基(mg/L):KH2PO410,K2HPO410,(NH4)2SO4200,MgSO4·7H2O6,微量元素溶液2mL/L,用大庆原油作为碳源。微量元素溶液(mg/L):FeSO4·7H2O500,ZnSO4·7H2O200,MnSO460,CaCl2·2H2O3000。普通培养基(g/L):牛肉膏5,蛋白胨10,NaCl5,水1000mL。pH为7。发酵培养基(g/L):NH4Cl3.04,K2HPO4·3H2O5.42,MgSO4·7H2O0.2,CaCl2·2H2O0.02。液体石蜡20mL。NH4Cl和KH2PO4均为分析纯。采用大庆油田现场的石油污染土壤。在实验室从石油污染土壤中驯化培养石油降解菌。蓬松剂为锯末。1.2实验方法1.2.1培养原油无机溶剂在装有100mL普通培养基的250mL锥形瓶中加入2g石油污染土壤,石油污染土壤有4个来源不同的试样,分别标记为1,2,3,4,将它们放入恒温震荡培养箱中,在35℃、转速为120r/min的条件下震荡培养,至培养液明显浑浊,取上层液50mL加入装有50mL无机培养基的250mL锥形瓶中,再将适当质量浓度的大庆原油直接加到该锥形瓶中作为微生物生长的碳源(大庆原油的初始质量浓度为200mg/L)。随后将锥形瓶放入恒温摇床,培养一定时间至培养液浑浊时,倒掉一半培养液换上新的含大庆原油的无机培养基,新培养基中的石油质量浓度比第一次增加。此后不断重复该过程并且逐步提高大庆原油的质量浓度,经过约3个月的培养,从4个试样中各得到一组可降解较高浓度石油污染物的菌株。1.2.2土壤样品的加入将沙与土体积比为1∶2的土壤先去除杂质,粉碎后于高温下干燥。取400g土壤加入1600mg大庆原油,适当加入NH4Cl和KH2PO4,充分混匀后,平均装入4个150mL的锥形瓶中,每瓶100g。然后分别加入一组石油降解菌,放入30℃恒温箱中,每隔10d测定其中石油烃的含量。1.2.3相同单元的石油降解菌石油污染土壤处理床分为5个单元。1单元至4单元,每个单元长4m,宽5m,深0.3m,投加质量相同的石油降解菌。1单元种大豆,2单元种碱草,4单元混锯末。2,3,4单元中无机营养NH4Cl和KH2PO4的加入量相同,1单元中NH4Cl的加入量减半。5单元为对照单元,长2m,宽2.5m,深0.3m,不加菌。石油污染土壤处理床的含湿量保持在15%~20%,自然通风。1.2.4加入处理单元将实验室筛选的高效石油降解菌经发酵培养基发酵后,等量加入各处理单元。定期补水,使处理床的含湿量保持在15%~25%,自然通风。定期多点采样分析。1.3分析石油烃含量的测定采用重量法;微生物菌数的测定采用平板稀释法。2结果与讨论2.1石油降解菌的降解能力通过驯化,从4个试样中各得到一组石油降解菌,分别标为D1,D2,D3,D4。4组石油降解菌的降解能力见表1。从表1可以看出,经过20d的降解,D1对石油烃的降解率最高,达到78.6%,所以后续实验将D1作为生物修复的石油降解菌。2.2石油烃降解率实验过程中各单元石油烃的降解情况见图1。由图1可见,经过135d的运行,1,2,3,4单元的石油烃降解率分别达到81.59%,83.26%,63.65%,72.94%,比对照单元40.75%的降解率高很多。1单元和2单元的石油烃残留量分别为410.22mg和372.96mg,均低于临界残留量500mg。第15天的采样结果表明,1~4单元的石油烃降解率为30.32%~31.76%,5单元稍高于这4个单元,是由于接种所用的石油降解菌通常都有一个适应期。15d后,1~4单元的石油烃降解率显著升高,均高于对照单元,因为此时石油降解菌已适应土壤的环境,开始降解土壤中的石油烃。实验期间5个处理单元的石油烃降解率大小顺序为:2单元>1单元>4单元>3单元>5单元。15d后3单元的石油烃降解率高于5单元,说明石油烃降解菌的加入加快了土壤中石油烃的降解。大豆、碱草、锯末的存在显著提高了土壤中石油烃的降解率。1,2,4单元的石油烃降解率大大高于3单元,这是因为,1单元大豆的根瘤能为土壤提供氮源,同时根际微生物和植物根系的生长加强了对土壤中石油烃的降解,2单元也是同理;4单元因为加入了锯末,使得土壤的通透性加强,微生物的呼吸作用加强,所以相对于3单元,它的石油烃降解率增大。2.3对土壤微生物菌数的影响实验过程中各单元微生物菌数的变化见图2。由图2可见,经过一段时间的运行,接菌单元土壤中微生物菌数明显高于对照单元。开始时,因接入的微生物有一个适宜土壤环境的过程,第15天以前,微生物菌数低于对照单元,以后则明显高于对照单元。这种趋势一直到第60天后才有所回落,但接菌单元土壤中微生物菌数仍然高于对照单元,甚至高出2个数量级以上。因为第60天以后易降解的有机物大部分已被降解,微生物得不到足够的营养,其生长受到限制,所以微生物菌数也开始不同程度地减少。由图2还可以看出,第15天后石油降解菌适应了土壤的环境,开始对石油烃进行降解,1,2,3,4单元微生物的菌数均开始不同程度地增加,但1,2单元的微生物菌数明显高于3,4单元,因为这时1单元中大豆的根瘤已慢慢形成,开始提供氮源,根系也开始生长、扩大,为土壤微生物提供了栖息地,并提供了营养,使微生物菌数开始大幅度增加,2单元中碱草因为根际环境的形成微生物菌数也大大增加,这两个单元的微生物菌数远远高于其他单元。第15天后由于石油降解菌开始降解石油,3单元的微生物菌数开始增加,但大大低于种植物的1,2单元。第60天后虽然微生物菌数都开始下降,但1,2单元仍高于3单元。2.4根际土壤石油烃的降解从实验进行的第30天起,到第90天为止,分别采集了1,2单元的根际与根外土壤,进行微生物菌数和石油烃含量的分析,结果见图3和图4。从图3和图4可见,大豆(1单元)、碱草(2单元)根际土壤的石油烃含量明显低于根外土壤,说明根际的石油烃得到很好的降解,大豆、碱草的根际微生物菌数明显多于根外土壤中的菌数,有时候甚至高出2个数量级以上。主要原因是植物根际与微生物的相互作用。由于根系的穿插,使根际的通气条件、水分状况良好,比根际外的土壤更有利于微生物的生长;另一方面,植物又可将大气中的氧气经叶、茎传输到根中,扩散到根际周围缺氧的土壤中,形成氧化的微环境,刺激了好氧微生物的生长。3不同植物根际土壤石油烃降解率及微生物菌数a)利用实验室筛选的高效石油降解菌,结合种植大豆、碱草等植物,对石油污染土壤进行生物联合修复。经过135d的处理,