黄单胞细菌白叶枯致病变种的致病基因克隆与分析

黄单胞细菌白叶枯致病变种的致病基因克隆与分析

水稻白叶旱是我国和亚洲水稻的主要病害，严重影响了水稻产量的持续增长，特别是水稻杂交问题。近年来,在澳大利亚﹑非洲﹑拉丁美洲和北美洲也有报道。虽然抗病品种的推广对病害控制起到明显作用,但由于病原细菌的变异使抗病性丧失的现象仍然屡屡发生。病原菌的变异主要是指小种的变异,而小种的变异与病原细菌无毒基因的结构与组成密切相关。通常我们所说的寄主-病原物互作,在宏观上是指作物品种与病原菌小种的互作,在微观上是指作物抗病基因与病原细菌无毒基因的互作。因此研究病原细菌无毒基因的结构与组成是阐明病原细菌变异机制的重要内容。同时对作物抗病性鉴定和病原细菌小种分化的研究也有重要意义。本研究在介绍寄主-病原物互作基本概念的同时,简要讨论了水稻白叶枯病菌小种及其无毒基因研究的有关问题以及本实验室的有关研究进展。1水稻黄单胞菌的致病性在病原物侵染寄主植物的过程中,寄主和病原物的相互作用决定发病表型和成灾过程。植物与病原物的相互作用,总体上可以分为亲和性和非亲和性互作两类,分别表现为感病和抗病反应。植物与病原物的互作类型受基因型组合调控并与生化特征有关。在基因-基因关系中,寄主抗病基因和病原物无毒基因均为显性(R/A)时表现为小种专化性抗性,而在其他基因组合(r/A,r/a和R/a)时则为感病表型(图1)。水稻黄单胞菌包括2个致病变种:水稻白叶枯致病变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae[Ishiyama]Dye,Xoo)和水稻条斑病致病变种(X.pv.oryzicola[Fangetal]Dye,Xooc)。这2个致病变种在生理生化和遗传上有诸多相似性,但致病过程和症状明显不同。作为一种“基因对基因”病害,植物病原细菌的无毒基因(avirulencegene,avr)和寄主植物抗病基因(resistancegene,R)的显性互作决定不亲和反应。在自然状况下,水稻白叶枯病菌在群体上存在小种分化,日本学者曾将Xoo划分为5个小种;菲律宾国际水稻所曾将菲律宾菌系划分为6个小种,现在已鉴定了10个小种;我国则报道有7个致病型。水稻白叶枯病菌小种的变化通常与栽培水稻品种的变化有关。小种变化决定于无毒基因组成,后者是病原菌致病性变异的关键因子。通过无毒基因产物(Avr)和抗病基因产物(R)的特异性识别作用激发带有特定抗病基因品种的特异性抗病反应。在此互作系统中,无毒基因产物是特异性激发子或与特异性激发子形成的相关物质,抗病基因产物是接受无毒信号的特异性受体并在信号传导中起作用。2处理水稻白叶枯病基因时致病反应植物病原细菌的无毒基因决定病原菌在特定植物品种上的无致病性或弱致病性,使其无法入侵含相应抗病基因的寄主植物或入侵后细菌不能大量增殖。在典型的基因-基因互作中,这种特异性诱导的抗病反应可以是过敏性反应(HR),但在水稻白叶枯病系统中通常并不表现HR,而只表现为致病性的数量变化,即病斑长短不同。迄今,已报道40多种植物病原细菌的无毒基因,主要来源于黄单胞菌和假单胞菌,大多位于染色体上,少数在质粒上,编码亲水性可溶蛋白,不具有典型的信号肽。大部分无毒基因只存在于病原菌的某些特定小种中,它们的缺失通常并不导致致病性的完全丧失。在已鉴定的植物病原细菌无毒基因中,除avrBs3/pth和avrRxv/yopJ(YopJ,YesiniaproteinJ)家族外,大部分没有或只有很少的同源性。2.1avrbs3/pth家族的互作和调节从辣椒斑点病菌(X.campestrispv.vesicatoria,Xcv)鉴定的avrBs3是该家族第一个被鉴定的无毒基因。由于从黄单胞菌(其中可能还包括青枯拉尔氏菌Ralstoniasolanacearum)发现的近30个该家族基因中有些属于致病基因(pathogenicitygene),所以该家族又称为avr/pth基因家族。avrBs3/pth家族的基因在寄主-病原物的互作中具有双重功能:在抗性寄主上引起HR,而在感病寄主上加重症状。在基因水平上,avrBs3/pth家族除编码蛋白有90%～97%的同源性外,其结构和组成也有许多鲜明的共同特点。avrBs3/pth家族成员在DNA序列上的特点是:基因大小在3kb左右,具有几乎一样的3′和5′端,中部含不同数目(13.5～25.5个)的102bp核苷酸(编码34个氨基酸)的重复序列,其后有一个亮氨酸拉链结构(LZ),3个核定位信号(NLS)和羧基端保守的酸性转录激活区(AAD)。通过不同来源的avrBs3家族成员基因序列的比较,发现不同成员间102bp核苷酸编码的34个氨基酸的重复序列数和第12～13位氨基酸构成了无毒基因的可变区。34个氨基酸的重复数和其中12～13个氨基酸的变化决定小种无毒专化性(图2-a),而其他结构则与细胞核互作和诱导防卫反应有关,因而决定细菌的毒性(图2-b)。图2说明avrBs3/pth家族无毒基因产物的特征以及与寄主互作的过程。首先无毒蛋白AvrBs3是通过细菌的Ⅲ型泌出通道被注入植物细胞内;在带有Bs3抗病基因的辣椒细胞中,NLSs基序与辣椒细胞中的内输协助因子(importinα)特异性互作,而后与内输协助因子(importinβ)一起使AvrBs3进入细胞核;进入核内的AvrBs3一方面调节寄主转录作用,另一方面通过依赖NLSs的识别作用激活寄主细胞的HR反应。虽然有些研究认为,importingα是基因-基因关系中受体-配体“看守模式”的致病性靶标,与AvrBs3结合时就会引起病害的发生。但酵母双杂交研究表明,importingα对AvrBs3和同源蛋白AvrBs4具有相同的结合能力,而且由辣椒Bs3抗病基因识别介导的HR反应并不能被AvrBs4所诱导。因此,该“看守模式”中致病靶标可能并不是importinα,而是位于寄主细胞核内的互作因子(图2-b)。一些黄单胞菌含多个完整的avrBs3同源物拷贝。如果连续失活这些avrBs3同源基因,这些细菌如棉花角斑病菌(X.c.pv.malvacearum)会加重在棉花上引起的水渍症状,而且此效应可以积累。缺失或功能域交换已证明病原菌的无毒性和毒性专化性是由这些重复单位决定的。将不同成员的中心区域进行改变或交换,无毒蛋白的特异性也随之发生改变,重复区数目的改变可以产生新的特异性。虽然已经知道34个氨基酸的重复序列不是起酶促作用,但这些重复序列是如何直接与R蛋白互作的还有待进一步证实。目前已发现这些蛋白可作为转录因子,诱导寄主基因的转录,并且每个Avr蛋白存在专化性的基因激活谱。研究还发现,avrBs3基因家族中重复序列的拷贝数还不足以决定无毒基因的特异性,重复序列的组合方式及其中特定可变区域氨基酸(第12～13位)的变化也有可能决定无毒基因的特异性。在这些蛋白中,羧基端亮氨酸拉链(leucinezipper,LZ)结构、核定位信号序列(nuclearlocalizationsignals,NLSs)和C末端酸性转录激活结构域(acidictranscriptionalactivationdomain,AAD)对与植物的相互作用也很重要,而且是激发HR所必需的。有些研究发现NLSs区缺失,也会使其在与植物互作中丧失识别能力,因此认为同源的R蛋白(如辣椒的Bs3基因对avrBs3)是在核内起作用的。但是也有研究发现,一些R蛋白如番茄的Bs4可以在细胞质中识别AvrBs3。一般认为,Avr蛋白的NLSs或AAD突变可能会使Avr蛋白结构发生改变,从而丧失其与R蛋白的互作能力。不过,内源的NLSs和AAD在功能上可以分别被异源的猴病毒SV40的大T-抗原的NLS和单一疱疹病毒蛋白16的AAD区域所替代,表明AvrBs3类蛋白的识别能力既依赖于重复区域结构上的完整性,又依赖于NLS和AAD区域的功能性,而且暗示着由R蛋白介导的细胞死亡是发生在核定位和基因激活的下游。关于基因-基因抗性的遗传模式,除寄主R蛋白作为受体与病菌的A蛋白作为配体的机制外,新近提出的“看守模式”认为,在R蛋白和A蛋白之间还应有一个来自寄主的蛋白(称为致病性靶标,P),A与P互作促进病害,这样才能解释一些R蛋白如RPM1和Mi-1的双重识别功能以及一些不相关的Avr蛋白可以被一种相同的寄主组分所看守。2.2avrbst和verpxv在细胞毒性作用上的变化该家族是一类来自动植物病原菌的序列相关的Ⅲ型效应分子。最先从植物病原细菌分离的该家族成员是从辣椒斑点病细菌(Xcv)中分离的,经同源性分析与Yersiniapseudotuberculosis的yopJ基因同源。后来发现属于avrRxv/yopJ家族的基因产物还包括哺乳动物病原菌(Y.enterocolitica)的YopP蛋白,辣椒斑点病菌的AvrBsT和AvrXv4,Pseudomonassyringae的ORF5和AvrPpiG以及Erwiniaamylovora和植物共生菌Rhizobiumspp.中的某些其他基因产物。计算机搜索发现,所有avrRxv/yopJ家族基因产物在其推测的蛋白酶催化位点上都有一些固定的残基。在Xcv的AvrBsT中,与YopJ同源的保守催化残基发生突变后,就会丧失在本氏烟(N.benthamiana)和辣椒上引起HR的能力;相反,在远离AvrBsT催化核心部位发生突变时,则对无毒活性没有影响。这说明蛋白酶的活性在AvrBsT引起的防卫反应中起重要作用,可能是植物免疫系统的一种识别靶标。AvrBsT引起的HR对细菌的寄生来说可能并不是有利的,除非它们以某种未知的机制起毒力作用。在本基因家族中既有植物病原菌,又有动物病原菌,表明它们来源于共同的祖先,可能拥有一种天生固有的免疫能力。但是,对这类效应蛋白在决定毒性作用方面还了解不多。该家族某些成员AvrBsT、AvrRxv和AvrXv4蛋白中也存在NLSs,这可能暗示它们的作用位点也位于植物细胞核上。但是迄今为止,尚无定位的研究报道,而且NLSs与毒性、无毒性的关系也不太清楚。3同源单一基因的检测由于水稻白叶枯病菌存在严格的限制修饰系统,从水稻白叶枯病菌中克隆致病相关基因的研究相对困难。因此,多数研究都是基于外源基因同源性克隆和鉴定。Hopkins等首先以辣椒斑点病菌avrBs3为探针,于1992年从水稻白叶枯病菌Pxo86基因文库中筛选到avrXa7和avrXa10两个无毒基因。当将它们导入毒性菌株Pxo99时,可以改变其在带抗病基因Xa7和Xa10品种上的互作表型。进一步分析证明,这2个无毒基因与双子叶植物黄单胞病原菌中的avrBs3具有同源性,在组织结构上属于一个基因家族。它们的102bp编码34个氨基酸的重复数分别为25.5和15.5个,并且在第12～13位氨基酸构成的可变区也有所不同。通过重复序列替换可以导致致病专化性改变。水稻白叶枯病菌的小种变化通常与栽培水稻品种的变化有关。我国粳稻品种主要带Xa3抗病基因,而籼稻品种主要带Xa4抗病基因。研究无毒基因avrXa3和avrXa4不仅具有现实意义,而且对进一步研究我国水稻白叶枯病菌小种变化和无毒基因组成的关系有重要意义。本实验室的工作菌株是JXOⅢ和JXOⅤ,它们在含Xa3的水稻品种(WaseAikoku3及IRBB3)和含Xa4的水稻品种(IR26及IRBB4)上分别表现为抗病反应。本实验室用转座子标签法、同源基因筛选相结合和PCR方法分别从JXOⅢ和JXOⅤ中获得了2个avrBs3/pth家族的同源无毒基因avrXa3和avrXa4。序列分析结果表明,其中34个氨基酸重复数分别为8.5个和12.5个,低于已报道的avrBs3家族成员所含最低重复数(13.5)(图3)。因此,决定小种专化性的34个氨基酸重复数最低限究竟是多少,以及决定一个小种无毒专化性的无毒基因中34个氨基酸重复数是否有严格的一致性值得进一步研究。在已克隆并经过仔细分析的水稻白叶枯病菌无毒基因avrXa7,avrXa10和avrXa3的C末端均含AAD和2～3个NLS。在avrBs3中已证明NLS对植物识别Avr蛋白是必需的,而AAD是植物防卫反应系统发挥作用所必需的。如果将C末端含AAD区域的38个密码子去掉或对C末端3个疏水氨基酸残基进行替换,都将同时丧失在水稻上的无毒功能和在酵母试验系统中的转录活性。另外,在AvrXa7中还证明其作为转录因子与富含dA/dT的双链DNA结合。本实验室的研究结果同样也发现,从一个表现无毒基因功能的基因文库克隆pUAV45中可以获得2个avrBs3的同源无毒基因。来自基因文库克隆pUAV45的一个BamHⅠ酶切片段(亚克隆pUAV5K)中发现含2670bp的avrBs3同源无毒基因avrXa3,而从另1个3720bp的EcoRⅠ酶切片段(亚克隆pUAV5E3)的C末端发现1个不完整的avrBs3无毒基因的同源序列。后者的1个ORF编码124个氨基酸,其中含3个NLS和1个AAD。将pUAV5E3导入Pxo99(菲律宾小种6)后,重组菌Pxo99/pUAV5E3表现出无毒基因avrXa3特异性无毒功能,即在含Xa3抗病基因的品种(WaseAikoku3)上减小致病性,而在原有感病品种Cas209和汕优63上增加致病性。这表明除102bp重复区域外,NLSs和AAD对于avrXa3的专化功能也是不可缺少的。当然,我们现在还不清楚pUAV5E3中的N′末端其他序列对这种专化功能是否有重要影响以及它在病原细菌中的作用。值得指出的是,从植物病原细菌中克隆的无毒基因并不都包含在上述2个基因家族中,不少无毒基因的功能还不了解。根据最近对avrXa21的研究发现,在PR6菌株中有2个基因(raxP和raxQ)是决定avrXa21活性所必需的。这是2个硫同化基因簇成员,分别编码ATP硫酸化酶和腺苷-5′-磷酸硫酸盐(APS)激酶。这些酶共同作用产生活化形式的硫酸盐﹑APS和3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐(PAPS)。2个基因无论哪一个被破坏,PR6菌株都不能产生APS和PAPS,并在带Xa21基因的水稻品系上表现致病表型。序列分析发现,raxP和raxQ与共生固氮细菌(Sinorhizobiunmeliloti)的寄主专化性有关。另外,从该菌株中还分离到1个与该固氮细菌硫酸盐化作用有关的基因raxST,说明硫酸盐化作用对AvrXa21的活性可能起重要作用。由于硫酸盐分子是许多组织中的配体或受体,因此,AvrXa21作为效应分子,无论是蛋白或碳水化合物,都有可能与Xa21的胞外结构域互作。根据本实验室对从JXOⅢ基因文库中筛选到的另1个含avrXa3无毒基因功能的阳性克隆pUAV47(36kb)的研究,发现其中EcoRⅠ+KpmⅠ亚克隆pUAV7E/K+1大小为4.629kb。转移结合子pXo99/pUAV7E/K+1与受体菌相比,在WaseAikoku3(Xa3)上致病性明显减弱。序列分析表明,其中2个