香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr检测

香蕉枯萎病菌fusariumoxisporum的pcr-pcr检测

由于仙童醇苯基乙烯的特殊化型（fusariumoxyspormf.c.c）引起的枯萎，是制约香蕉生产的毁灭性疾病。这是真菌性土壤传递的疾病。这种疾病从根本原因而受到影响，导致导管棕褐色和系统感染，整个植物死亡。现在，中国对小品种1号和4号造成的破坏最为严重。通常由感病植株的症状变化来鉴定此病,但是产生典型症状的植株往往已到发病后期,而且可能已经威胁到其它的植株,因此对该病的早期检测诊断就显得尤为重要。利用核糖体rDNA序列在物种进化中的保守性和易变性,及其在系统发育中具有种级以上阶元标记的特性,设计引物,用于植物病害的早期检测,已经在棉花、番茄、西瓜等作物的病害检测中得到了应用。在香蕉枯萎病的研究中漆艳香、谢艺贤及BentleyS等,利用RAPD-PCR方法对香蕉枯萎病菌2个生理小种间的亲缘关系进行了研究,刘景梅等建立了广东香蕉枯萎病菌RAPD分析技术,华南农业大学的周鸿飞等也做过相关的检测研究,但至今尚无详细的文献报道。本试验通过对致病性镰刀菌ITS序列的克隆分析,设计了两对引物,对香蕉镰刀菌枯萎病有较高的灵敏性和特异性。对香蕉枯萎病的快速检测提供了良好的技术方法,在国内对于香蕉枯萎病菌的分子检测及其感病植株的早期检测的报道尚属首次。1材料和方法1.1试验材料供试尖饱镰刀菌菌株由分离自不同寄主的不同专化型组成,其它种属菌株均是分离自香蕉和芒果等作物致病菌的单菌落纯培养,见表1。1.2方法1.2.1感病植株的制备用1.0%NH4NO3,0.5%K2HPO4,0.25%MgSO4,3%葡萄糖培养基接种菌丝后25℃振荡培养3d,产生的大量菌丝,过滤后于冷冻干燥机上冻干40h。感病植株采自海南省乐东市郊区蕉园,分别取其根、球茎、假茎和叶片0.1g提取模板DNA。病组织及干燥后的菌丝体经液氮研磨成粉状。1.2.2sds-ctab法取20mg菌丝或组织干粉于2.0mL离心管中,加入400μL65℃预热提取缓冲液(50mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA;1%PVP)悬浮干粉,混匀,加入终浓度为2%的10%SDS(约80μL),65℃温育30~40min。12000g4℃离心10min。取上清加入1/5倍体积5×CTAB(5%CTAB;1.0mol·L-1NaCl;50mmol·L-1EDTA,pH8.0;250mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0)65℃继续温育10min,冷却后加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)反复颠倒充分混匀,12000g4℃离心10min。取上清液,再加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提。12000g4℃离心10min。在上清液中加入0.6倍体积的预冷无水乙醇沉淀DNA(室温放置30min),12000g4℃离心10min。取沉淀,加70%乙醇洗2遍,干燥,TE(10mmol·L-1Tris-HCl,pH8.0;0.1mmol·L-1EDTA)溶解DNA,-20℃保存。1.2.3有效引物的设计根据真菌通用引物ITS1和ITS4扩增的产物克隆测序结果,通过与网上公布的其他镰刀菌ITS序列的比对,设计一个正向引物FusF1,两个反向特异引物FusR1和FusR2。测序由大连宝生物基因工程有限公司完成,引物由赛百盛生物工程有限公司合成。1.2.4dntpmitywellPCR扩增反应采用大连宝生物基因工程有限公司TaqDNA聚合酶产品,包括TaKaRaTaqTM5U/μL,10×PCRBuffer(Mg2+Plus),dNTPMixture(含dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM)。反应总体积为25μL(18μLddH2O,2.5μLdNTP,2.5μL10×PCRBuffer,0.5μLTaqTM,20pM的引物各0.5μL,模板DNA为25ng),PCR反应在BiometraTgradientPCR仪中进行,扩增体系为94℃预变性4min,94℃变性30s,58℃退火50s,72℃延伸1min,35个循环后72℃延伸10min,最后于4℃保存。1.2.5琼脂糖胶电泳PCR扩增反应产物于含有0.3ng/mLGoldViewTM(北京赛百盛基因技术有限公司)的1%琼脂糖胶上进行电泳,点样量为5μL反应液和2μLLoadingBuffer,电泳缓冲液为TBE缓冲液(0.089MTris-borat,0.089Mboricacid和0.002MEDTA)。电泳结束后,于紫外成像仪上观察结果并扫描于计算机软件中保存。2结果与分析2.1xysporaprapet-pcr检测gna图1为两对引物对引起香蕉枯萎病的病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubense1号和4号生理小种gDNA的PCR扩增反应结果,图中显示两对引物对两个生理小种都分别有长度大约为300bp和400bp的扩增片段。2.2两种引物对尖镰孢菌小种的影响图2应用两对引物对镰刀菌及其它植物病原菌gDNA的PCR扩增结果表明,两对引物对镰刀菌属的尖镰孢菌小种都有特异性的目的扩增片段,对其它植物致病菌以及镰刀菌的其它小种无明显的扩增产物。说明两对引物对尖镰刀菌有较高的特异性,但对不同专化型的生理小种的区分能力有限。2.3引物对bg图3为两对引物对F1模板DNA稀释不同倍数后的PCR反应结果,表明,引物对B模板DNA浓度稀释到10-5浓度为10pg时有明显的扩增片断,引物A在模板浓度为100fg时仍有扩增产物。试验结果表明引物对目的菌株有着较高的灵敏度,能检测到较低丰度的目的DNA模板量。2.4引物敏感性对病原菌dna扩增的影响在对感病植株不同组织部位总gDNA的检测中,两对引物的敏感性不同,引物A只对病体组织中病根有扩增结果,而引物B则对病根、球茎和假茎低丰度病菌DNA都有特异性的扩增片段,两个结果清晰,且对寄主基因组DNA无假阳性扩增(见图4)。3schiing对香蕉的检测能力和灵敏度应用核糖体rDNA的ITS序列的保守性作为植物病原菌的鉴定检测手段,已经在植物病害的研究中广泛应用,朱有勇等以ITS序列设计合成的引物能对引起棉花黄萎病的大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)进行有效的分子鉴定和分子检测;易建平结合线粒体DNA和核糖体DNAITS序列的特异性引物对小麦腥黑穗病的检测有着较高的检测灵敏度。KamelA根据ITS序列设计合成的引物ITS-Fu-f和ITS-Fu-r在对引起棉花枯萎病的病原菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectu)检测专化性和灵敏性做了深入研究。本试验结果和大量报道均表明,应用核糖体ITS序列设计的引物对病原真菌的检测有较高的灵敏度,Schiling应用特异性引物对Fusariumculmorum和F.graminearium的检测下限分别为50pg和5pg,Moricca等对F.oxysporumf.spvasinfectum的检测下限为50fg~100ng。本试验中,特异性的引物A在对香蕉镰刀菌菌丝体基因组的检测能力较引物B的强(图3),但是后者却对感病组织的特异性扩增有着较好的检测能力(图4),这可能与香蕉组织中大量的糖和多酚类物质的干扰有关,高灵敏度的特异性引物在对低丰度目标DNA的检测能力易受各种因素的干扰,如老叶、老茎或根组织的糖、蛋白、次生代谢物,以及土壤腐殖酸等物质的影响。但是,研究同样指出,ITS扩增的特异性较低,最高只能达到种,较少能达到亚种、专化型和生理小种以下的特异性要求,本试验中引物对不同专化型的尖镰刀菌区分能力有限,但是田间接种表明其它专化型的菌株不能引起香蕉致病,所以对一些专化性要求较高病原菌的检测则需其它辅助的检测手段,如线粒体DNA序列或一些具有种、亚种以下的特征标记。试验验