利用微卫星标记分析皖系长毛兔1岁时产毛量

利用微卫星标记分析皖系长毛兔1岁时产毛量

微卫星dna重复序列（微卫星审问序列）也称为简单序列重复序列（ssr），由1.6bp重复序列组成，由两名侧翼序列组成。侧翼序列以特定的方向定义微卫星组在特定组的特定位置。由于微卫星具有高度多态性,在基因组中含量丰富且分布均匀等优点,这一技术很快便发展为继第一代分子标记(RFLP)之后的第二代分子标记(Nakamura等,1987),并在自然种群的许多研究中得到了广泛应用。随着研究的不断深入,有关微卫星功能的资料在不断积累。概括起来,微卫星的功能主要有以下几个方面:有些微卫星(通常为4～6个碱基重复型)存在于结构基因的转录区,并且编码氨基酸;染色体末端的微卫星有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能;位于DNA调控区的微卫星有提高或降低临近基因转录速率的作用;微卫星区可能是基因重组的热点,是基因变异的来源;部分微卫星具有产生转录启动复合物或活化染色体的功能。因此,尽管大部分微卫星有“自私性”行为,没有明确的生理功能,只是采取了某种策略来确保自身的存活,但部分微卫星序列确实是功能基因的一部分。目前已利用微卫星标记构建了人类、小鼠、大鼠、鸡和家蚕等许多物种的染色体遗传图谱,并且已被广泛应用于基因定位及克隆、疾病诊断、亲缘分析、品种鉴定、动物育种、进化研究等领域。本研究利用微卫星标记技术,分析4个微卫星座位的多态性与皖系长毛兔1岁时的产毛量之间的相关,以期为长毛兔产毛量标记辅助选择提供理论依据。1材料和方法1.1不同年龄的长毛兔血样的制备在安徽省农业科学院畜牧兽医研究所种兔场随机抽取健康、发育良好的1岁皖系长毛兔共同51只(11♂,40♀),测定1岁时产毛量(剪毛),于耳缘静脉抽取3ml血样,肝素钠抗凝,于-20℃下冷冻保存、备用。1.2pcr扩增及电泳参照文献的方法提取基因组DNA。试验所采用的4对微卫星引物由上海生工生物工程技术公司合成,引物序列见表1。PCR反应体积为25μl:其中模板50～100ng、10×buffer2.5μl、25mMMgCl22.0μl、dNTP200μmol/L、引物各0.1μmol/L、Taq酶1U。PCR反应条件为:95℃预变性5min;95℃变性1min,55℃～60℃退火1min,72℃延伸1min,34个循环;最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经8%变性聚丙烯酰胺凝胶200V电泳6～8h,银染拍照。根据不同基因片段电泳迁移率的不同,利用Kodak成像软件KDSZD2.0计算其片断长度。1.3统计方法1.3.1微卫星座上的等位基因等位基因频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率。计算公式如下:Pi=[2(ii)+(ij3)+(ij2)+……(ijn)]/2n式中:Pi为第i个等位基因的频率;i为某一微卫星座位上的第i个等位基因;j1、j2……jn为与i共显性的第1到第n个等位基因;n为该微卫星座位上等位基因数目。微卫星呈共显性遗传,因此对测得的基因型进行简单的统计计算即可得到等位基因的频率。1.3.2微卫星座等位基因数目基因杂合度表示群体在微卫星座位上为杂合子的比例。计算公式如下:H=1−Σi=1nPi2Η=1-Σi=1nΡi2式中:n为微卫星座位上等位基因数目;pi代表第i个等位基因的频率。1.3.3微生物等位基因数目多态信息含量是表示微卫星DNA变异程度高低的一个指标,反映微卫星DNA多态性高低。计算公式如下:PIC=1−Σi=1nPi2−2Σi=1n−1Σj=i+1nPi2Pj2ΡΙC=1-Σi=1nΡi2-2Σi=1n-1Σj=i+1nΡi2Ρj2式中:n为微卫星座位上等位基因数目;pi和pj分别代表第i和第j个等位基因的频率。1.3.4数据分析采用SPSS11.5软件包中广义线性模型(GLM)对皖系长毛兔1岁时产毛量与4个微卫星座位的相关性进行最小二乘方差分析。2结果与分析2.1微卫星座位上的等位基因在皖系长毛兔上,4个微卫星座位上共检测到18个等位基因,在一个微卫星座位上检测到等位基因最多的为6个,最少的为3个(见表2)。平均每个座位上的等位基因为4.5±1.29个。图1至图4为4个微卫星标记的扩增结果。2.2条件三:自变量基因型根据4个微卫星座位的等位基因频率,计算得到的皖系长毛兔群体基因杂合度和多态信息含量见表3。由表3可知,皖系长毛兔群体平均基因杂合度为0.680,其中微卫星Sol33座位的基因杂合度最高,为0.721;微卫星Sat4座位的基因杂合度最低,为0.630。皖系长毛兔群体的平均多态信息含量为0.642,其中微卫星Sol33座位的多态信息含量最高,为0.705;微卫星Sat4座位的多态信息含量最低,为0.559。2.3不同微卫星座位的聚合酶基因型检测利用最小二乘法分析皖系长毛兔1岁时产毛量与微卫星座位的相关性,结果见表4。由表4可知,在4个微卫星座位中,只有Sol33微卫星座位与皖系长毛兔1岁时产毛量呈显著相关(P<0.05)。其他座位Sat4、Sat13和Sol44与皖系长毛兔1岁时产毛量相关不显著(P>0.05)。在Sol33微卫星座位上,共检测到5种基因型,其中,基因型为AD和BD个体1岁时产毛量与其他3种基因型个体间均存在显著差异(P<0.05)。基因型为AD个体与基因型为CE个体1岁时产毛量相差最大,相差约78g。3功能性状对长毛兔产毛利用分子遗传标记的多态性可以衡量群体的基因杂合度。基因杂合度又称为基因多样度,群体的平均基因杂合度是度量品种变异的一个最适参数,平均基因杂合度大小可以近似地反映出遗传结构变异程度的高低。皖系长毛兔4个微卫星座位的平均基因杂合度为0.680,说明该群体具有较高的群体杂合度和丰富的遗传多样性。本研究中皖系长毛兔的平均基因杂合度比韩春梅等所报道的吉戎兔的平均基因杂合度要高,比赵进等所报道的长毛兔的平均基因杂合度要低,其原因可以是各自所采用的兔种和微卫星标记不同,以及微卫星座位数的多少不同所造成的。多态信息含量是衡量基因片段多态性较好的指标。当PIC>0.5时,该座位为高度多态性座位;当0.25<PIC<0.5时,为中度多态性座位;PIC<0.25时,为低度多态性座位。同时多态信息含量关系到该座位可用性及使用效率,多态信息含量越大,在一个群体中,该座位杂合子比例则越大,提供的遗传信息就越高。本研究中皖系长毛兔的平均多态信息含量为0.642,且所选用的4个微卫星座位上的多态信息含量均大于0.5,说明这4个微卫星座位是高度多态性座位,与赵进等所报道相同的4个微卫星座位的结果相一致。本试验利用最小二乘法分析,结果表明皖系长毛兔1岁时产毛量与Sol33微卫星座位呈显著相关。可能该微卫星座位与控制长毛兔产毛量的主基因相连锁。目前,国内外在家兔上关于这方面的报道几乎没有,但在其他畜禽品种上的报道较多。如VanKaam等研究发现LEI166微卫星座位对肉鸡48日龄体重和饲料报酬有显著影响。VanKaam等、Tatsuda等发现鸡1号染色体上可能存在控制鸡体重的QTLs。周群兰等报道位于8号和3号染色体上的3对微卫星座位ADL278、LEI166和MCW222与鹿苑鸡12周龄体重呈显著相关。邵根宝等研究发现猪13号染色体上部分微卫星座位与苏太猪肉质性状存在显著相关。储明星等报道有6个微卫星座位上的不同基因型对北京荷斯坦牛乳房炎抗性有利。这些研究结果均表明,微卫星标记作为畜禽育种辅助选择的分子标记,可以加快畜禽育种进