第三章 食品与蛋白质工程

第三章

食品与蛋白质工程蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的化学键：

氢键

1肽单元参与肽键的6个原子C

1、C、O、N、H、C

2位于同一平面，C

1和C

2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折叠(

-pleatedsheet)

-转角(

-turn)

无规卷曲(randomcoil)

2

-螺旋3

-折叠4

-转角和无规卷曲

-转角无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。定义蛋白质的三级结构肌红蛋白(Mb)N端C端亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。蛋白质的四级结构蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。血红蛋白的四级结构

第一节概述一、蛋白质工程的涵义

定义：蛋白质工程是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰分子设计，对现存蛋白质加以改造，组建新型蛋白质的现代生物技术。蛋白质的特点：①蛋白质的分子质量非常大②蛋白质的功能需要生理条件下发挥作用③蛋白质(酶)的专一性很强蛋白质工程主要是通过化学、物理及酶学期对蛋白质进行加工、修饰，从而得到符合人类需要的功能特性的蛋白质。二、理性分子设计和非理性分子设计理性分子设计：在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的序列，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子。非理性设计（定向进化）：是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，得到具有特性预期的新蛋白质的一种蛋白质工程技术。三、蛋白质工程在食品工业中的应用天然酶制剂优点：高效、特异的催化活力缺点：分子质量很大，仅有一个活性中心，催化效率低；对环境因素如温度、pH和重金属离子等比较敏感分子修饰考虑的问题：①改变亚基间静电相互作用强度；②改变邻近残基间氢键数目；③替换易被氧化和化学修饰的残基；④减少蛋白质从伸展到折叠过程的自由能等。改变酶的特性：①提高稳定性包括热稳定性、抗蛋白酶稳定性、抗氧化稳定性和有机溶剂稳定性等。②提高酶活力酶活力中心及调控部位少数几个关键氨基酸残基在空间排列③改变酶的选择性改变电荷分布，亲／疏水性及立体结构第二节理性分子设计和

定位突变技术一、蛋白质理性分子设计的基本步骤(1)了解蛋白质的三维结构查找PDB(2)确定突变位点及替换的氨基酸利用计算机模拟技术(3)预测修饰后的蛋白质结构利用能量优化及蛋白质动力学方法①应确定对蛋白质折叠敏感的区域②互换或插入／删除残基时应考虑它们对结构特征的影响③确定对功能非常重要的位置注意

二、定位突变定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质(酶)分子的一种蛋白质工程技术。目前常用的定位突变方法有：（一）寡核苷酸引物介导的定位突变（二）重组PCR介导的定位突变（三）盒式突变寡核苷酸引物介导的定位突变的原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。

（一）寡核苷酸引物介导的定位突变

寡核苷酸引物介导的定位突变将待突变基因克隆到突变载体上，制备含突变基因的单链模板引物与模板退火，使5’端磷酸化的突变寡核苷酸引物与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链DNA合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链DNA分子转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌.将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13单链DNA中作为模板，以含有要改变的碱基的一段寡聚核苷酸作为引物，在体外用DNA聚合酶进行双链DNA的合成，用DNA连接酶连接成环状将杂合DNA双链再转入大肠杆菌中将含突变目的基因的M13噬菌体筛选出来，提取它们的DNA，用限制性内切酶把突变目的基因切下，并重组到表达质粒中M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术寡核苷酸引物介导的定位突变法优点保真度比重组PCR突变法高缺点操作环节复杂、周期长克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制寡核苷酸引物介导的定位突变常产生突变效率低的现象（二）聚合酶链式反应(PCR)介导的定位突变法利用PCR将插入和缺失的突变碱基均设计在引物中

用两对引物分别对核酸进行PCR扩增，通过重叠延伸产生带有部分重叠序列的两个PCR产物

产物经过混合、变性、复性和链延伸后，再用一对与两个待接片段外侧互补的引物进行第二次扩增

产生出全长的异源杂合双链DNA

（三）PCR介导的定位突变法优点：操作较简单，突变的成功率可达100％缺点：①后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录和转译；②TaqDNA聚合酶的保真性偏低，因此PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其他突变。（三）盒式突变技术在目标基因中选择合适的限制性内切酶位点用含有突变序列的DNA片段来置换目标基因上的一段DNA序列产生突变序列被集中在目标基因的一个特定区域的突变家族盒式突变法优点：简单易行、突变效率高可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点缺点：合成多条引物的成本较高三、定位突变技术在酶结构改造中的应用

(一)淀粉酶利用蛋白质工程提高各种淀粉酶的热稳定性(二)蛋白酶增加酶活力，增强抗氧化性(三)脂肪酶提高酶稳定性(四)纤维素酶及木聚糖酶提高热稳定性第三节体外定向进化一、蛋白质的体外定向进化蛋白质的体外定向进化又称分子进化，就是在实验室条件下模拟自然进化机制，对编码蛋白质的基因进行随机诱变、重组，再通过高通量筛选或选择方法定向选择出性能更加优良的蛋白质，创造出新蛋白质的一种蛋白质工程技术。定向进化与定位突变的不同点是它不需要已知蛋白质的结构信息，所以该技术又称非理性设计。DNA体外进化的过程主要包括：①通过随机突变或基因重组创造基因多样性，建立突变文库；②突变体在适当生物体内表达；③高通量筛选检出由一个氨基酸置换而引起的预期性状改善，精确选取阳性结果，供进一步进化④此过程的不断循环直至获得预期性状的新型蛋白质。

定向进化的基本策略与自然进化两个关键的步骤都是产生分子多样性和定向筛选，而且方法都是随机诱变和体外重组。定向进化与自然进化的不同在于：(1)进化动力不同保守突变是自然进化的驱动力，而定向进化中非保守突变取代可明显改进蛋白质的功能。(2)进化方向不同定向进化是人为制造特殊条件，模拟自然进化机制，使进化过程定向进行，主要是蛋白质突变的适应积累。(3)进化速度不同定向进化只需几年、几月、几周甚至几天而自然获得满意的结果。而自然界出现的突变则是一个非常缓慢的过程，需几百万年。定向进化=随机突变+选择二、DNA改组DNAshuffling：即将DNA拆散后重排。它是模仿自然进化的一种DNA体外随机突变方法。这种方法不仅可以对一种基因人为进化，而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组，共同进化出一种新的蛋白质。

DNAshuffling基本过程包括四个步骤：1、目的基因片段的准备：根据不同的需要选择一个基因或其片段，也可以是几个序列上具有较高同源性的基因；2、DNaseI酶切：将基因随机切割成约10-50bp或300bp左右的小片段；3、不加引物的PCR：在Taq酶的作用下将切割后的DNA重叠小片段重新连接起来，在这个过程中可能发生许多突变和重组；4、加引物的PCR：加入目的基因片段两端的引物，使连接好的DNA得到扩增，筛选正突变,得到的正突变子又可以重复进行DNAshuffling，使性状进一步提高。三、容错PCR容错PCR：指在利用Taq聚合酶进行目的基因的PCR扩增的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变的一种DNA体外进化技术是一种简单、快速、廉价的随机突变方法。原理：通过改变PCR的条件，通常降低一种dNTP的量（降至5%-10%）使PCR易于出错，达到随机突变的目的。还可以加入dITP来代替被减少的dNTP，又会使下一轮循环中出现更多的错误。在PCR缓冲液中另加入Mn2+，亦有利于提高突变率。四、体外随机引发重组体外随机引发重组（random-priminginvitrorecombination,RPR）：以单链DNA为模板,配合一套随机序列引物,先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段,由于碱基的错配和错误引发,这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中,它们互为引物进行合成,伴随组合,再组装成完整的基因长度。如果需要,可反复进行上述过程,直到获得满意的进化酶性质。该法优于DNA改组法的特点在于：（1）RPR可以利用单链DNA为模板,故可10～20倍地降低亲本DNA量;（2）在DNA改组中,片段重新组装前必须彻底除去DNaseⅠ,故RPR方法更简单;（3）合成的随机引物具有同样长度,无顺序倾向性。在理论上，PCR扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变;（4）随机引发的DNA合成不受DNA模板长度的限制。五、交错延伸交错延伸（staggerextensionprocess,StEP）的原理：在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间(55℃,5s),从而只能合成出非常短的新生链,经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行,直到产生完整的基因长度,结果产生间隔的含不同模板序列的新生DNA分子。优点：StEP法重组发生在单一试管中,不需分离亲本DNA和产生的重组DNA。它采用的是变换模板机制,这正是逆转录病毒所采用的进化过程。该法简便且有效,为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具。

六、定向进化技术在酶制剂改造中的应用运用定向进化技术对现有酶制剂进行改良，已获得了许多满意的结果。提高酶的催化活力和稳定性是人们对酶蛋白进行改造的两个最基本愿望。定位突变(理性设计)与定向进化(非理性设计)各具特色，定位突变一般应用于已知蛋白质的结构与功能改造，用于在分子中引入关键性的残基或结构模块。定向进化则不需要预先了解蛋白质的结构与功能，适用于分子质量大的蛋白质分子。定向进化常常用来改变蛋白质的精细结构，有利于蛋白的空间折叠和产生新的功能。因此，定向进化也可为定位突变提供新的信息和基因改造空间，蛋白质的定向进化比定位突变具有更宽的研究空间和更多的优越性。第四节融合蛋白技术一、融合蛋白概念和用途（一）定义融合蛋白(fusior·ofproteins)技术是另一项蛋白质工程技术。该技术是有目的地把两段或多段编码功能蛋白的基因编码区首尾连接在一起，由同一调控序列控制所构成的基因表达产物，进而表达所需蛋白。（二）用途(1)融合蛋白技术的出现为解决在大肠杆菌等原核生物中表达出具有生物活性、折叠正确的重组蛋白提供了可能(2)外源基因与宿主本身蛋白的部分序列构成融合基因(3)融合蛋白技术的出现为研究出更多、更好的基因工程靶向药物提供了方便融合（三）融合蛋白技术的特点融合基因可在原核细胞(如大肠杆菌)也可在真核细胞中进行表达。原核表达系统的特点是时程短，费用低，是科研中的主要工具。其缺点是真核蛋白表达没有得到确切修饰；大量蛋白常常沉淀成不溶性包涵体聚合物，需要复杂的变性和复性过程；大量蛋白的分泌较困难。真核表达系统的特点是蛋白翻译后加工机会多，甚至可被改造成人源型；真核细胞易被转染，具有遗传稳定性和可重复性；产物可被分泌，提纯简单，成本低。二、融合蛋白技术的方法构建融合蛋白的基本原则是，将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，以实现两个基因的共同表达。具体步骤有：1.进行目的基因的克隆：根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以cDNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段。2.在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒。3.将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序。4.融合基因的诱导表达及表达蛋白的纯化。关键在于：一般来说，3-5个氨基酸的Linker可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。有人尝试在融合蛋白间加入一段有疏水性和一定伸展性的较长肽链，如(Gly4Ser1)，目的是将两者分开，以缓解相互干扰作用，并获得了满意的结果。但具体涉及到每种蛋白时，需具体分析。当我们构建融合蛋白时，应多选择几种融合方式，从中优化出理想的连接方式。另外，大量研究表明连接肽的柔性和疏水性对不扰乱蛋白质的功能结构域是十分重要的。遗憾的是，目前对于连接肽序列的设计还没有可靠的选择标准。现在，大多数连接肽序列的设计和选择仍主要依赖于直觉。尽管依赖于蛋白质的一级结构来预测其二级结构已经产生了重大的进步，但是我们对于序列和结构之间