动物细胞培养技术 2010

细胞培养技术张才乔浙江大学动物科学学院前言

1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。组织培养中热门的研究领域

1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。组织培养的分类及基本概念

分类:1.组织培养(TissueCulture)指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。2.细胞培养(CellCulture)培养物是单个细胞和细胞群。3.器官培养（OrganCulture）培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。组织培养的细胞生物学特点:1.体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。培养细胞的分化

细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。不适应细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。脱分化（去分化）（Dedifferentiation）

由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。培养细胞的分化

不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。培养细胞的分化

培养细胞的形态

1.贴附型：1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等3）游走型细胞：神经胶质细胞4）多形型细胞：神经组织细胞2.悬浮型：如癌细胞培养细胞的生长和增殖

1.原代培养（PrimaryCulture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cellline）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。3.衰退阶段：自发性转化：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）:细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinitecellline)或连续细胞系(Continuouscellline)。如：BHK（仓鼠肾成纤维细胞），F9（小鼠胚胎癌细胞），M2R（黑色素瘤细胞）等。培养细胞的生长和增殖

培养细胞的传代培养

当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。

细胞传代的三个阶段

1）潜伏期（Latentphase）：细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。二倍体细胞该期时间长（24~96h）；连续细胞系时间短（10~30min）。

2)指数生长期（Logarthmicgrowthphase）：细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitoticindex，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。细胞传代的三个阶段

指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contactinhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Densityinhibition）3)停滞期（Stagnatephase）：即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。细胞传代的三个阶段

细胞培养的基本条件

1)仪器和设备:常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。细胞培养的基本条件

3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。超净台

超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。

滤器培养板培养瓶CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：

①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。

②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。SectionaldiagramthroughacompoundlightmicroscopeMagnificationversusresolution细胞培养的基本条件4)平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸监度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。常用的有PBS，Hank’s等。5)抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。6)其它添加成分：缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31；HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。有机补充物，如丙酮酸钠，谷胺酰氨等。促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。细胞培养的基本条件培养液的物理性质

pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。温度：温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。渗透压：培养液渗透压一般介于260~320mosm/kg之间。人类血浆渗透压290mosm/kg，小鼠类为310mosm/kg。粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。表面张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。培养液的物理性质

细胞培养的基本方法

1.组织、细胞的解离方法1.1解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。解离时应注意:1)尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；2)剪碎组织时，避免损伤组织块；3)解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。解离细胞常用酶和鳌合剂进行解离：当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；从单个细胞出发获得细胞群体；从一定量的组织中获得最多的细胞量时。解离细胞的方法1）胰蛋白酶解离细胞法：所需时间较短，主要缺点是破损细胞。2）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。3）机械解离细胞法：比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。4）螯合剂解离细胞法：分离效果差原代细胞培养

1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。2）单层细胞培养：每隔1~3d换液一次，细胞长成单层后传代培养。3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。原代细胞培养

细胞培养中应注意的几个问题

1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。

4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2~0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。5）去除死细胞6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。细胞培养中应注意的几个问题

细胞系及其鉴定

原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系(Cellline)。细胞克隆技术

培育细胞系可采用细胞克隆技术。一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。细胞克隆技术的方法1.稀释铺板法2.饲养层克隆法3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法4.琼脂克隆法5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法细胞系鉴定当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:1)细胞