第34章 DNA的复制和修复(改)

Replication＆RepairofDNAChapter34DNA的复制和修复王镜言生物化学（下册）问题1：复制子（replicon）基因组能独立进行复制的单位复制起点特征（复制原点，origin,ori）富含AT的区段？问题2：DNA复制需要的酶和蛋白质问题3：DNA复制为什么需要引物？问题4：DNA复制需要的条件？DNA复制引物切口（nick）：DNA的某一条链失去一个磷酸二酯键缺口（gap）：失去一段单链NH3+COO-5’

3’外切酶3’

5’外切酶5’

3’聚合酶Klenow片段蛋白酶有限水解大片段（Klenow片段）：聚合酶、3’→5’核酸外切酶的活性合成时起校对功能，并负责切除引物DNApolI：小片段：5’→3’核酸外切酶活性参与DNA损伤修复DNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ（polⅡ、polⅢ）：DNApolⅡ：修复酶，没有5’→3’核酸外切酶活性DNApolⅢ：DNA的复制酶（replicase）全酶(holoenzyme)大约10种亚基组成，含Zn2+

DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ）亚基组成核心酶：5’→3’DNA聚合：3’→5’外切酶,校对：组建核心酶γ复合物（夹子装配器）：核心酶二聚化：倚赖DNA的ATP酶：形成复合物：形成复合物：形成复合物：形成复合物：两个形成活动夹子提高酶持续合成能力DNA聚合酶IV和V当DNA受到严重损伤时，诱导产生这两种酶能跨越损伤部位，以克服复制障碍为目的，进行DNA的错误倾向修复（errorpronerepair）DNA连接酶（DNAligase）：E.coliDNAligase：催化双链DNA中一条链切口处的5’-P与3’-OH连接形成磷酸二酯键。能源：动物ATP；细菌NADT4DNAligase：在模板链的基础上连接DNA和DNA之间的切口连接平头和粘性双链DNA

连接DNA-RNA、RNA-DNA、RNA-RNA之间的裂口拓扑异构酶（topoisomerase）：引起拓扑异构反应的酶I型：能使DNA一条链断裂和再连接，无需能量，如：拓扑异构酶I（蛋白），广泛存在于原核和真核生物；主要集中于转录活性区，与转录有关Ⅱ型：能使DNA双链断裂和再连接，引入超螺旋时需要ATP供能。如：拓扑异构酶II（细菌DNA旋转酶）；主要分布于染色质骨架蛋白及核的基质部位，与复制有关DNA解螺旋酶（helicase）功能：解开DNA双链；通过水解ATP获得能量，每解开一对碱基需要水解两个ATP。水解ATP活力需要单链DNA存在参与DNA复制的解螺旋酶：DnaB（5’

3’）参与DNA修复的解螺旋酶：解螺旋酶I、II、III（5’→3’）

rep蛋白（3’→5’）（六）DNA的半不连续复制：冈崎（1968）1、概念：DNA、RNA合成方向5’→3’DNA双链沿复制叉移动时，子链合成方向相反一条链合成方向与复制叉同向，连续复制（前导链）另一条链合成方向与复制叉方向相反，不连续（滞后链、随后链）3’滞后链5’前导链10~60Nt5’3’5’3’复制叉移动方向

冈崎片段（Okazakifragments）：DNA复制过程中出现不连续片段原核：1000-2000Nt真核：100-200Nt引物：<10Nt

RNA短片段(RNA引物合成酶)DNA复制的过程复制体（replisome）：DNA合成的复制叉上，各种与复制有关的酶和蛋白因子结合着形成一种离散的复合体。复制过程：起始,延伸和终止1、E.coli

中DNA复制相关因子及其功能DnaA：识别起点（oriC）序列，并打开DNA双链HU：类组蛋白，与DNA结合并使其弯曲，解开富含AT区DnaB：解螺旋酶，借助ATP水解能量，从5’→3’解开DNA，活化引物合成酶（DnaG）DnaC：帮助DnaB结合于起点SSB：单链DNA结合蛋白。与DNA单链结合，防止双链恢复，保护单链DNA不被水解。DnaG：RNA引物合成酶RNA聚合酶：促进DnaA活性；在线粒体、质粒中合成引物DNA旋转酶：引进负超螺旋，消除解链产生的扭曲张力2、E.coli中DNA复制起始成串排列的三个13bp序列（开链区）

DnaA蛋白结合位点四个9bp序列OriC(245bp)共有序列GATCTNTTNTTTT共有序列TTATCCCACADnaA各带一个ATPDnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型HU蛋白DnaC起始复合物(DnaA+oriC)开链复合物(+HU蛋白)前引发复合物(+DnaB,C,T,PriA,B,C)(DNA旋转酶)解螺旋酶(DnaB)引物合成酶(DnaG)RNA引物引发体DNA复制的延伸E.coliDNA复制终止1）引物的消除和缺口的填补：在合成冈崎片段后，由DNA聚合酶I降解引物RNA，并填补缺口。最后由DNA连接酶连成完整长链2）E.coliDNA复制终止环状DNA两个复制叉相遇于终止区并停止复制，复制体解体残余50-100bp未复制区，通过修复方式填补拓扑异构酶IV（类型Ⅱ）作用下，解开连锁体复错不要紧，只要校对真，错了我一个，还有后来酶真核生物DNA的复制1、核小体：核小体的核心（组蛋白八聚体）DNA以左手螺旋绕组蛋白核心1.75圈，约146bp,每形成一个核小体，相当于引入1.2个负超螺旋。多复制起点，双向延长组蛋白的复制是全保留，原组蛋白八聚体留在前导链上；滞后链上的核小体由新合成组蛋白组装2、复制体组成差异：真核生物复制体组成有较大差异，但复制方式类似细菌及真核生物复制体组成差异3、真核生物DNA的复制方式的差异DNA复制叉移动速度：细菌复制叉移动速度为50，000bp/min,大肠杆菌染色体完成复制需要20-40min真核生物染色体DNA的复制子长度100-200kb，复制叉移动速度为1，000-3，000bp/min，每一复制单位在30-60min内复制完成，染色体完成需要6-8h

起始频率：大肠杆菌复制速度取决于起始频率，快速生长时一个染色体可以连续发动复制真核生物染色体复制完成之前起点不再重新开始复制复制起点:oriC多复制叉染色体4、端粒和端粒酶端粒（telomere）：真核生物染色体两个末端各有一个特殊结构，由成串的重复序列组成端粒功能：稳定染色体末端结构，防止末端粘连；补偿复制链5’-末端的RNA引物空缺端粒酶（telomerase）：一种逆转录酶。以所含15-22Nt的RNA为模板，合成因复制缩短的DNA5’-末端，维持端粒长度存在于性细胞以及癌细胞5’3’3’5’端粒合成的完成进一步加工TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交继续延伸端粒：生命时钟？端粒合成的一种模型三、DNA的损伤与修复DNA既稳定，但也脆弱（一）DNA的损伤某些理化因子（紫外线、电离辐射和化学诱变剂等）作用于DNA，造成其结构和功能的破坏，从而引起生物突变和致死的效应常见DNA损伤方式——嘧啶二聚体的形成1、DNA分子的自发损伤：哪些因素能影响到DNA的完整性？

细胞内源因素环境因素：化学试剂、污染物和UV线疾病治疗：离子辐射和化疗1）细胞内源因素：碱基错配自发性化学变化：碱基异构、碱基脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶、碱基修饰、链断裂复制错误：四种dNTP量的不平衡导致错配DNA本身不稳定：碱基自发脱氨基、脱嘌呤/脱嘧啶导致碱基脱落活性氧的作用：DNA,蛋白质和脂质的氧化DNA分子自发脱嘌呤作用和自发脱氨基作用2）环境（外源）因素化学试剂天然化合物：黄曲霉素人造化合物：苯并芘-香烟、顺铂-化疗药物物理因素UV离子辐射：γ-射线、x-射线活性氧（ROS）正常细胞代谢产生导致DNA、蛋白质和脂质损伤常见形式：过氧化氢（H2O2）超氧化物自由基（O2•-）一氧化氮（•NO）羟基自由基（HO•）过氧亚硝基阴离子（O=NOO-）烷过氧化物（ROOH）烷氧自由基（RO•）1）碱基错配尽管DNA聚合酶具有校对修复功能，仍存在极少量的错配（10-10）2）自发性化学变化碱基异构、碱基脱氨基、脱嘌呤、脱嘧啶、碱基修饰、链断裂3）物理因素：紫外线、电离辐射、DNA链断裂、交联4）化学因素：烷化剂对DNA的损伤：碱基烷基化、碱基脱落、断链、交联碱基修饰剂、类似物对DNA的损伤：

人工促变剂、抗癌药物、亚硝酸盐、黄曲霉毒素等2、DNA损伤的后果1）DNA分子的改变：点突变、缺失、插入、倒位、易位、链断裂2）DNA损伤的结果：（1）致死性（2）丧失某些功能（3）改变基因型而不改变表现型（4）发生有利于物种生存的结果，生物进化DNA损伤类型碱基修饰碱基丢失（无碱基位点）复制错误

链断裂蛋白质-DNA交联

DNA-DNA交联DNA损伤的因素和损伤的主要类型活性氧的碱基修饰作用鸟嘌呤的甲基化导致碱基错配紫外线引起的碱基损伤离子辐射引起的DNA链断裂（二）DNA的修复生物在长期进化过程中获得的一种能使DNA的损伤得到恢复的保护功能DNA是唯一一种在损伤后可以被完全修复的分子，其他生物大分子损伤后或被降解，或被取代。并非所有损伤都能修复。如果损伤不能及时修复，可导致细胞的癌变、早衰

DNA损伤后，选择处理方法是尽量将其修复而不是将其降解，1）作为遗传物质的DNA分子在细胞内只有一个拷贝，如果将其水解的话，细胞也就失去了存在的根基；2）DNA的互补双螺旋结构使得修复受损DNA分子变得很容易DNA的修复机制被科学杂志评为1994年的年度分子直接修复切除修复错配修复双链断裂修复易错修复重组修复……2005年，122卷第5期DNA错配和修复（李国民）理学学士：武汉大学生物系理学博士：美，韦恩州立大学美国肯塔基大学，副教授1、错配修复（MMR）尽管出错几率十分微小生命这台精密的仪器不允许任何差错即使一个碱基的错配也可能造成严重的疾病错配修复基因缺陷：癌症（遗传性非多发性息肉结肠癌）（hereditarynonpolyposiscolorectalc