定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术及其临床应用

定量聚合酶链反应(Q-PCR)测定技术

及其临床应用卫生部临床检验中心李金明PCR?

PCR只是一个简单的不起眼玩艺

——凯利·穆利斯（KaryMullis)

PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为新的概念。…

它最大的特点就是能不断推出新形式。

——摘自[MakingPCR:AStoryofBiotechnologybyPaulRabinow]什么是PCR?

我不认为PCR能够用两种“革命”(政治革命和科学革命)加以说明。……它的发明并没有改变基因操作的本质。有了PCR，我们能在更广的范围内更快、更容易地进行基因操作，学术界也完全不用等到某人死去或退休后才能接受PCR。它只不过是一种新工具。——凯利·穆利斯（KaryMullis)PCR及有关技术的发展历史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在这年底（12月16日第一次成功实验）发明了PCR。PCR发明过程的简单回顾PCR及有关技术的发展历史（2）1985关于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上发表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)PCR及有关技术的发展历史（3）1987当年7月Cetus公司在美国获得PCR基本技术专利批准。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus仪器公司（PECI）于这一年的11月推出了第一个PCR试剂产品及第一台热循环仪。1989Science报道了耐热性DNA多聚酶Taq酶的发现,预示着分子时代的到来。12月《Science》杂志将PCR和它所使用的聚合酶命名为第一个“年度分子”。Hoffmann-LaRoche公司和Cetus开始合作将PCR应用于临床诊断。PCR及有关技术的发展历史（4）1990Cetus科学家D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯化TaqDNA多聚酶的方法。第一个PCR试剂盒用于HLA定量检测分析。Cetus科学家H.Erlich和K.Mullis在德国临床化学领域获得生化分析奖。1991TaqMan技术发表。当年11月Hoffmann-LaRoche公司从Cetus获得全球的PCR专利权。RocheMolecularSystems创建了单一耐热多聚酶rTth进行RT-PCR技术，并用于临床RNA病毒检测。耐热逆转录酶首次由Cetus科学家发现并报道。

PCR及有关技术的发展历史（5）1992当年3月Cetus公司获得Taq酶、热循环扩增仪等专利；1993AMPLICORHCV*首次用于临床RNAPCR标准试剂盒。

KaryMullis

因PCR的发明获得诺贝尔化学奖。PCR及有关技术的发展历史（6）

九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测1999年西方发达国家尝试将PCR应用于血液筛查PCR循环–第一步–加热变性靶序列靶序列PCR循环-第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR扩增过程图示PCR扩增的理论模式

PCR扩增为指数扩增，每一扩增周期后产物的量可以下式表达：Yn=Yn-1·(1+E)=Yn-2·(1+E)2=…=X·(1+E)n

0≤E≤1其中E表示扩增效率，Yn表示在n个周期后PCR产物的分子数量，Yn-1为n-1个周期后PCR产物的分子数量。等式仅在限定的扩增周期数（通常为20或30）内成立。超过此周期数，扩增过程即由指数扩增降低至稳定的扩增速率，最终达到平台，不再扩增.影响PCR扩增效率的因素:PCR定量的困难?引物/靶的杂交反应试剂的相对量样本在扩增仪中的位置的不同临床样本中DNA聚合酶抑制物的存在PCR扩增模板的量靶核酸链的再退火及酶过量可致E降低PCR和定量问题

高浓度/高效率

高浓度/低效率

低浓度/高效率

N : 扩增分子的数目n : 扩增循环的次数log-phaseanalysisNnend-pointanalysis定量PCR与定性PCR测定的最根本的区别

定量PCR测定的测定点为PCR扩增的指数扩增期;而定性PCR测定的测定点则多为PCR扩增的平台期。定量PCR的方法定量PCR方法可归为三大类，即外标方法、动力学方法和内标共扩增方法定量还可分为绝对定量（即测定X的分子数量）和相对定量（即测定不同样本中X的比率）

用外标准的定量PCR方法使用外标的定量PCR方法的优缺点优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；缺点：（1