大学生物遗传学：第十一章原核基因表达调控

第十一章原核基因表达调控Controlofgeneexpressioninprokaryote第一节操纵子

operonTableofcontent几个重要概念一、调控可分为正调控与负调控二、结构基因簇中各成员是协同调控的三、Lac操纵子基因的表达受阻抑物控制四、乳糖操纵子是可诱导的五、阻抑物由小分子诱导物所控制六、用顺式作用的组成型突变来鉴定操纵基因七、用反式作用的突变来鉴定调控基因八、多亚基蛋白质具有特殊的遗传性九、阻抑物结合于操纵基因上Tableofcontent十、阻抑物结合诱导物后从操纵基因上脱离十一、阻抑物单体具有多个结构域十二、阻抑物由两个二聚体组成四聚体十三、阻抑物与DNA的结合是通过别构作用来调节的十四、突变体的表表型与结构域的构型有关十五、阻抑物与三个操纵基因结合并与RNA聚合酶相互作用十六、操纵基因与低亲和力位点竞争性地结合阻抑物十七、阻遏可发生在多个基因座上十八、启动子与操纵基因相对位置具有多样性十九小结几个重要概念

顺式作用（cis-acting）不转变为其他形式（RNA或蛋白质）而只以DNA形式在原来位置起作用的DNA序列发辉作用的过程。反式作用（trans-acting）基因的编码产物从合成地点扩散到其它场所而起作用的过程称反式作用。♣结构基因（structuralgene）编码各类具有不同结构和功能的蛋白质的基因（或rRNA基因、tRNA基因）。♣调控基因（regulatorgene）编码蛋白质或RNA来调节其他基因表达的基因。♣操纵基因（operator）DNA上的一个位点，阻抑物能与之结合抑制相邻启动子起始转录。阻抑物（repressor）能阻止基因表达的蛋白质，它可与DNA操纵基因结合来阻止转录或结合RNA来阻止蛋白质的翻译。操纵子（operon）细菌基因表达和调控的单位，包括结构基因和能被调控基因产物识别的DNA控制元件。lactoseoperonThesimplestformoftheregulatorymodel：AregulatorgenecodesforaproteinthatactsatatargetsiteonDNA一、调控可分为正调控与负调控♣负调控（negativecontrol）阻抑物与操纵基因结合来阻止有关基因的表达。♣正调控（positivecontrol）调控因子通过与启动子元件结合来激活基因的表达。Innegativecontrol,atrans-actingrepressorbindstothecis-actingoperatortoturnofftranscription.Inpositivecontrol,trans-actingfactorsmustbindtocis-actingsitesinorderforRNApolymerasetoinitiatetranscriptionatthepromoter.正调控和负调控的共同点：

调控蛋白作为反式作用因子，通过与顺式作用元件相互作用激活或抑制基因表达。虽调控蛋白与DNA结合长度较长，但仅靠识别DNA上的短序列(常小于10bp)起作用。二、结构基因簇中各成员是协同调控的对同一条代谢途径中的某些蛋白质，通常编码它们的基因在DNA上也紧密排列在一起，作为一个转录单位转录出多顺反子mRNA。Thelacoperonoccupies~6000bpofDNA.ThelonglacZgeneisfollowedbythelacYandlacAgenes.三、Lac操纵子基因的表达受阻抑物控制位于lac基因簇起点的启动子与操纵基因具有重叠区域；阻抑物与操纵基因结合就可控制lacZYA基因簇的转录。阻抑物是由lacI基因编码、具有4个相同亚基的四聚体。RepressorandRNApolymerasebindatsitesthatoverlaparoundthetranscriptionstartpointofthelacoperon.-5~+21lacI基因编码的阻抑物(repressor)四、乳糖操纵子是可诱导的可以对操纵子进行诱导的小分子，其结构通常与操纵子所表达的酶的底物的结构相同或类似。β-半乳糖苷（含乳糖）是lacZYA基因编码的酶可识别的底物。β-半乳糖苷不存在时，乳糖操纵子的表达水平极低。加入β-半乳糖苷可诱导乳糖操纵子中三个结构基因的转录。AdditionofinducerresultsinrapidinductionoflacmRNA,andisfollowedafterashortlagbysynthesisoftheenzymes;removalofinducerisfollowedbyrapidcessationofsynthesis.ResultsofexperimentwhencellsofE.coliaregrownintheabsenceofaβ-galactoside,thereisnoneedforβ-galactosidase,andtheycontainveryfewmoleculesoftheenzyme—say,<5.Whenasuitablesubstrateisadded,theenzymeactivityappearsveryrapidlyinthebacteria.Within2-3minutessomeenzymeispresent,andsoonthereare~5000moleculesofenzymeperbacterium.(Undersuitableconditions,β-galactosidasecanaccountfor5-10%ofthetotalsolubleproteinofthebacterium.)Ifthesubstrateisremovedfromthemedium,thesynthesisofenzymestopsasrapidlyasithadoriginallystarted.五、阻抑物由小分子诱导物所控制诱导物可使阻抑物失活。阻抑物具两个结合位点，分别与操纵基因和诱导物结合。当阻抑物与诱导物结合后，发生别构效应使DNA结合位点的性质改变，不能再和操纵基因相结合，这样就不能抑制转录起始。Repressormaintainsthelacoperonintheinactiveconditionbybindingtotheoperator.TheshapeoftherepressorisrepresentedasaseriesofconnecteddomainsasrevealedbyitscrystalstructureAdditionofinducerconvertsrepressortoaninactiveformthatcannotbindtheoperator.ThisallowsRNApolymerasetoinitiatetranscription.β-galactosidaseβ-galactosidepermeaseβ-galactosidetransacetylase六、用顺式作用的组成型突变来鉴定操纵基因♣调控通路中顺式作用元件的突变可能消除操纵子的表达，也可能导致不受控制的表达。1）使操纵子在任何情况下都不能表达的突变称为不可诱导型突变（uninduciblemutation）；2）不受调控物影响的持续表达称为组成型基因表达，这种突变称为组成型突变（constitutivemutaion）♣这些突变是顺式的，只影响邻近区域DNA上的基因。Operatormutationsareconstitutivebecausetheoperatorisunabletobindrepressorprotein;

thisallowsRNApolymerasetohaveunrestrainedaccesstothepromoter.TheOcmutationsarecis-acting,becausetheyaffectonlythecontiguoussetofstructuralgenes.七、用反式作用的突变来鉴定调控基因lacI基因的突变是反式作用的，它可影响细菌内所有lacZYA基因簇的表达。使lacI基因失活的突变可导致组成型表达。阻抑物上诱导物结合位点的突变使它不会失活，因而这会引起操纵子的非诱导性。MutationsthatinactivatethelacIgenecausetheoperontobeconstitutivelyexpressed,becausethemutantrepressorproteincannotbindtotheoperator.注意：

Oc突变是顺式显性的（cis-dominant）lacI-型突变则是反式隐性的(trans-recessive)八、多亚基蛋白质具有特殊的遗传性活性阻抑物由4个相同亚基组成的四聚体。lac-d突变发生在DNA结合位点。只有阻抑物中4个亚基的DNA结合位点都处于正常时，整个蛋白质才具有活性。Whenitispresentinthesamecellasawild-typegene,multimericrepressorsareassembledatrandomfrombothtypesofsubunits.AlacI–dmutantgenemakesamonomerthathasadamagedDNAbindingsite.ItonlyrequiresoneofthesubunitsofthemultimertobeofthelacI–dtypetoblockrepressorfunction.

九、阻抑物结合于操纵基因上阻抑物结合于操纵基因的双链DNA序列中。操纵基因是一短的回文序列。操纵基因的每个反向重复序列结合一个阻抑物亚基。Thelacoperatorhasasymmetricalsequence.Thesequenceisnumberedrelativetothestartpointfortranscriptionat+1.十、阻抑物结合诱导物后从操纵基因上脱离阻抑物与诱导物结合后发生构象变化，使它与DNA的亲和力降低，因而从操纵基因上脱离。Twomodelsforreleasingrepressor十一、阻抑物单体具有多个结构域阻抑物单体可分为三部分：N端DNA结合结构域、铰链区和核心区。DNA结合结构域具有两个α螺旋，用来与DNA大沟结合。负责多聚化的区域和诱导物结合位点都位于核心区。ThestructureofamonomerofLacrepressoridentifiesseveralindependentdomains.十二、阻抑物由两个二聚体组成四聚体两个单体通过核心结构域2之间的接触和负责寡聚化的螺旋之间的接触形成二聚体。两个二聚体通过寡聚化螺旋之间的相互作用形成四聚体。Therepressortetramerconsistsoftwodimers.Dimersareheldtogetherbycontactsinvolvingcoredomain2aswellasbytheoligomerizationhelix.Thedimersarelinkedintothetetramerbytheoligomerizationinterface.十三、阻抑物与DNA的结合是通过别构作用来调节的阻抑物单体的DNA结合结构域插入到DNA的大沟。在活性阻抑物中，二聚体的两个DNA结合域可以插入连续的双螺旋转角。诱导物的结合使阻抑物构象改变，这样两个DNA结合位点不能形成正确的几何构象以维持与DNA的同时接触。InducerchangesthestructureofthecoresothattheheadpiecesofarepressordimerarenolongerinanorientationthatpermitsbindingtoDNA.十四、突变体的表型与结构域的构型有关不同类型的突变发生在阻抑物亚基的不同结构域Thelocationsofthreetypeofmutationsinlactoserepressor:1）RecessivelacI–mutantsthatcannotrepresscanmapanywhereintheprotein.2）DominantnegativelacI–dmutantsthatcannotrepressmaptotheDNA-bindingdomain.3）DominantlacIsmutantsthatcannotinducebecausetheydonotbindinducermaptocoredomain1.十五、阻抑物与三个操纵基因结合并与RNA聚合酶相互作用阻抑物四聚体中的每个二聚体都可以与一个操纵基因结合。若要完全阻遏转录，阻抑物除结合lacZ操纵基因（originaloperator）外,同时还要结合一个上游-83或下游+410的“操纵基因”（pseudo-operator）。阻抑物结合到操纵基因可促进RNA聚合酶与启动子结合,但结合的RNA聚合酶不能起始转录。IfbothdimersinarepressortetramerbindtoDNA,theDNAbetweenthetwobindingsitesisheldinaloop.(ThebluestructureinthecenteroftheloopedDNArepresentsCAP(orCRP),anotherregulatorproteinthatbindsinthisregion).十六、操纵基因与低亲和力位点竞争性地结合阻抑物当诱导物不存在时，操纵基因与阻抑物的亲和力比低亲和力位点与阻抑物的亲和力高107倍。每个细胞含10个阻抑物分子，这保证了在绝大多数情况下，操纵基因都是与阻抑物结合的.(EscherichiacoliK12,

4639675bpcircularDNA)诱导使阻抑物从操纵基因直接转移到低亲和力位点。当细胞内有效DNA浓度减少时,上述参数也会发生变化。Allbut0.01%ofrepressorisboundto(random)DNA.Sincethereare~10moleculesofrepressorpercell,thisistantamounttosayingthatthereisnofreerepressorprotein.Lacrepressorbindsstronglyandspecificallytoitsoperator,butisreleasedbyinducer.VirtuallyalltherepressorinthecellisboundtoDNA.

RepressionaffectsthesitesatwhichrepressorisboundonDNA十七、阻遏可发生在多个基因座上阻抑物可以作用于具有操纵基因靶序列的任何基因座。Thetrprepressorrecognizesoperatorsatthreeloci.Conservedbasesareshowninred.ThelocationofthestartpointandmRNAvaries,asindicatedbythewhitearrows.十八、启动子与操纵基因相对位置具有多样性Operatorsmaylieatvariouspositionsrelativetothepromoter.十九、小结1）转录调控是通过反式作用因子和顺式作用位点的相互作用来进行的。

反式作用因子是调控基因的产物，通常为蛋白质，也有可能是RNA，它可以在细胞内扩散，因此可以作用于任何合适的靶基因。

位于DNA或RNA上的顺式作用位点是通过反式作用因子识别并在原位发挥作用的序列,它没有编码功能,并只对空间上紧密相连的序列起调节作用。2）细菌中编码功能相关的蛋白质（例如某个代谢途径中的一系列酶）的基因通常位于同一个基因簇中，由单一启动子转录出多顺反子mRNA,这样,控制了这个启动子就可以控制整个代谢途径。包括结构基因和顺式作用元件在内的调控单位,称为操纵子。3）转录的起始调控是通过启动子附近蛋白质与DNA的相互作用来实现的。

RNA聚合酶对转录的起始作用可以被其他蛋白质阻遏或增强。若一条基因平时都有活性,被阻抑物关闭时则失活,则其调节方式称为负调控。若一条基因只有与调节蛋白质结合时才具有活性，其调节方式称为正调控。4）阻抑物可以阻止RNA聚合酶与启动子结合或阻止其激活转录。阻抑物结合的靶序列-操纵基因，通常定位在转录起点的附近。操纵基因的序列比较短，通常具有回文结构。阻抑物通常是同源多聚体，其对称性反映了结合靶位的对称性。5）阻抑物与操纵基因结合能力可由小分子调节。诱导物(如β-半乳糖苷)可以阻止阻抑物与靶位点的结合，辅阻抑物(如色氨酸)可以活化这种结合。与诱导物或辅阻抑物结合会导致阻抑物DNA结合位点的结构改变。无论阻抑物是游离的还是已经与DNA结合的，都可以发生这种别构效应。6）一个蛋白质若与DNA上的特定靶序列亲和力很高，那么它必然与其他DNA序列的亲和力较低，两者亲和力的比值即为专一性。由于基因组中非特异性位点要远多于特异位点,基此靶序列的特异性必须足够大,以克服大量非特异性的竞争。细菌调节蛋白质的数量和特异性之间存在一种平衡，在活化状态，它允许对靶位点的识别；在关闭状态下，它允许几乎所有蛋白质从靶位点上释放出来。第二节调控线路

RegulatoryCircuits

TableofContents一、前言二、区分正调控与负调控三、葡萄糖阻遏作用调控碳源的利用四、cAMP是CRP的诱导剂,可激活CRP作用于许多操纵子五、CRP在不同的靶操纵子中的作用方式不同六、CRP促使DNA弯曲七、应急应答产生(p)ppGpp八、(p)ppGpp由核糖体生成九、ppGpp有许多作用十、翻译是可调控的十一、r-蛋白合成的自主调控十二、T4噬菌体p32合成的自主调控过程TableofContents十三、自主调节常用来控制大分子聚合物的合成十四、可变性二级结构调控衰减作用十五、大肠杆菌色氨酸操纵子(trpoperon)受衰减作用控制十六、衰减作用可以为翻译所控制十七、反义RNA（antisenseRNA）可以抑制基因表达十八、小RNA分子可以调节翻译十九、细菌内含有调节因子RNA二十、在许多真核生物中，微小RNA是调节因子二十一、RNA干扰与基因沉默有关二十二、小结一、前言

♣表达水平上的调控以DNA为靶标的转录水平上的调控以RNA为靶标的翻译水平上的调控

♣调控因子可能是蛋白质也可能是RNA。♣调控既可以表示调控因子关闭（或者抑制）了靶标的表达，也可以表示调控因子起始（或活化）了靶标的表达。♣若多条基因均含有其调控因子识别的序列或结构，则这些基因的表达可由该调控因子共同调控。♣调控因子本身也可能被调控，最典型的就是被一些小分子所调控，而这些小分子的产生是周围环境所致。♣调控因子如受到其他调控因子调控，则构成了复杂的调控线路。(一)调控因子直接调控靶标（二）一个调控因子直接调控另一个调控因子的活性。二、区分正调控与负调控正调控基因只有存在活性调控因子时，它才会表达。负调控基因只有在没有阻抑物的情况下是一直表达的。诱导(使转录发生)：可以通过使阻抑物的失活来实现，也可以通过活化其激活剂来实现。阻遏(使转录不能发生):可以通过使激活剂的失活来实现，也可以通过活化阻抑物来实现。据对调控操纵子表达的小分子所产生的不同应答的特性，操纵子可分为：诱导型操纵子(inducible)：只有小分子诱导物(small-moleculeinducer)存在时才发生转录。阻遏型操纵子(repressible)：只有小分子辅阻遏物(small-moleculecorepressor)不存在时才发生转录。Controlcircuitsareversatile.

三、葡萄糖阻遏作用调控碳源的利用当大肠杆菌对碳源进行选择时，它优先利用葡萄糖。葡萄糖防止了从培养基中吸收可替代碳源。从细胞中排除其他碳源阻止了编码代谢这些碳源的酶的操纵子的表达。GlucoseisimportedthroughthePtssystem.ThiscausestheLacpermeasetobeinactivated.Theabsenceoflactosemeansthatthelacrepressorswitchesofftheoperon.Whenglucoseisabsent,lactosecanbeimported,andinactivatesthelacrepressor,sotheoperonisswitchedon.Pts:glycosephosphotransferasesystem四、cAMP是CRP的诱导剂，可激活CRP作用于许多操纵子CRP是一种可以与某个启动子的靶序列结合的激活剂。CRP二聚体可以由cAMP分子激活。CyclicAMPhasasinglephosphategroupconnectedtoboththe3`and5`positionsofthesugarring.adenylatecyclaseATP

cAMPByreducingthelevelofcyclicAMP,glucoseinhibitsthetranscriptionofoperonsthatrequireCRPactivity.

ThelevelofcyclicAMPisinverselyrelatedtothelevelofglucose.注意：CRPCRP蛋白是一种激活剂。该激活剂控制了大肠杆菌中的多种操纵子活动。这种蛋白质是一种正调控因子。CRP只有在cAMP的存在下才有活性，因此cAMP可以作为经典的小分子诱导物。五、CRP在不同的靶操纵子中的作用方式不同注意：CRP因子：是一个由两个相同亚基组成的二聚体，每个亚基为22.5kDa,二聚体可以被单个分子cAMP激活。CRP单体包含一个DNA结合区和一个转录激活区。CRP因子与DNA结合后，形成cAMP.CRP.DNA复合物。在应答的启动子上，CRP二聚体约结合22个碱基，结合位点在共有序列中有所变化，但有些序列却是保守的。在CRP所调控的操纵子中，其结合位点坐落于自起始位点的不同位置上。TheconsensussequenceforCRPcontainsthewellconservedpentamer

TGTGAand(sometimes)aninversionofthissequence(TCANA).TheCRPproteincanbindatdifferentsitesrelativetoRNApolymerase.六、CRP促使DNA弯曲CRP在它的结合位点可使DNA成90℃弯曲。CRPbendsDNA>90°aroundthecenterofsymmetry.七、应急应答产生(p)ppGpp应急应答（stringentresponse）：

当细菌发现它们处于很差的生长环境，没有足够的氨基酸来维持蛋白质合成时，它们就会停止大部分活动，这种现象称为应急应答。应急应答产生两种非正常的核酸堆积物[有时又称预警子(alarmone)]，即ppGpp和pppGpp，统称(P)PPGPP。(P)PPGPP的作用是协同调控大量的分子活动。(P)PPGPP水平和细菌生长速率一般呈相反关系。应急应答使得rRNA和tRNA的合成量大幅减少（10-20%），一些mRNA的合成也减少（1/3）。蛋白质的降解速率增加，许多代谢调节作用开始发生。

八、(p)ppGpp由核糖体生成应急因子RelA是一种(p)ppGpp合成酶，约与5%的核糖体结合在一起。当A位被空载tRNA占据时，RelA被激活。一个空载tRNA进入A位就生成一个(p)ppGppStringentfactorcatalyzesthesynthesisofpppGppandppGpp;ribosomalproteinscandephosphorylatepppGpptoppGpp.Innormalproteinsynthesis,thepresenceofaminoacyl-tRNAintheAsiteisasignalforpeptidyltransferasetotransferthepolypeptidechain,followedbymovementcatalyzedbyEF-G;Butunderstringentconditions,thepresenceofunchargedtRNAcausesRelAproteintosynthesize(p)ppGppandtoexpelthetRNA.九、ppGpp有许多作用ppGpp阻止rRNA的转录。在编码rRNA的操纵子中，启动子上转录起始被特异地抑制。ppGpp能缩短许多或大部分模板的转录延伸期，原因可能是ppGpp引起的不断增高的RNA聚合酶的暂停反应。ThefiguresummarizesthesystemsthatareusedtocontrolrRNAtranscriptioninresponsetogrowthrate.NucleotidelevelscontrolinitiationofrRNAtranscription.Thismeansthattheproductionofribosomes,andthusthelevelofproteinsynthesis,inturnrespondtothelevelsofATPandGTP,whichreflectthenutritionalconditionofthecell.十、翻译是可调控的一种翻译调节方式：

与mRNA上靶区结合的蛋白质通过阻遏核糖体识别起始区来实现阻抑物的功能，这和与DNA结合的阻抑物防止RNA聚合酶识别启动子的机制是相对应的。AregulatorproteinmayblocktranslationbybindingtoasiteonmRNAthatoverlapstheribosome-bindingsiteattheinitiationcodon.ProteinsthatbindtosequenceswithintheinitiationregionsofmRNAsmayfunctionastranslationalrepressors.另一种翻译调控方式：

一个顺反子的翻译需要前一个顺反子翻译所引起的二级结构变化来调控。Secondarystructurecancontrolinitiation.OnlyoneinitiationsiteisavailableintheRNAphage,buttranslationofthefirstcistronchangestheconformationoftheRNAsothatotherinitiationsite(s)becomeavailable.Thecistronsalwaysareexpressedinasetorder.十一、r-蛋白合成的自主调控r-蛋白（核糖体蛋白，ribosomalproteins）操纵子的翻译是由此操纵子的表达产物来控制的，该产物可与多顺反子mRNA上某个位点结合。Genesforribosomalproteins,proteinsynthesisfactors,andRNApolymerasesubunitsareinterspersedinasmallnumberofoperonsthatareautonomouslyregulated.Translationofther-proteinoperonsisautogenouslycontrolledandrespondstothelevelofrRNA.Amechanismtolinkr-proteinsynthesistorRNAsynthesis.Aboutautogenousregulation:

Autogenousregulation:

thegenecodingfortheregulatoryproductisitselfoneofthetargetsforregulation.

negativeautogenousregulation:

theregulatoryproteininhibitsexpressionofacontiguoussetofgeneswithintheoperon.十二、T4噬菌体p32合成的自主调控过程p32与其自身的mRNA结合来阻遏翻译的起始。T4噬菌体基因p32表达的蛋白质p32在遗传重组、DNA修复和复制中起着主要作用，它的功能是由它与单链DNA的结合能力来决定的。基因的无义突变使无活性蛋白质过量表达，因此当p32蛋白功能被阻遏后，就会有更多的该p32蛋白产生，这个效应发生在翻译水平上。Excessgene32protein(p32)bindstoitsownmRNAtopreventribosomesfrominitiatingtranslation.Gene32proteinbindstovarioussubstrateswithdifferentaffinities,intheordersingle-strandedDNA,itsownmRNA,andothermRNAs.BindingtoitsownmRNApreventsthelevelofp32fromrising>10-6M.十三、自主调节常用来控制大分子聚合物的合成微管前体，即游离的微管蛋白，可抑制微管蛋白mRNA的翻译。Tubulinisassembledintomicrotubuleswhenitissynthesized.AccumulationofexcessfreetubulininducesinstabilityinthetubulinmRNAbyactingata