高温修复联合酶消化法在肾组织石蜡切片免疫荧光染色中的应用

高温修复联合酶消化法在肾组织石蜡切片免疫荧光染色中的应用

免疫荧光检查是肾激活诊断中不可或缺的手段之一。然而,行免疫荧光检查的冰冻组织常无肾小球,如何弥补这一缺憾,文献有众多方法。我们采用高温高压联合酶修复法进行抗原修复,效果甚佳。免疫荧光法检测小鼠血清荧光指标病例选择选择在南京军区南京总医院全军肾脏病研究所住院经肾活检明确诊断的患者50例。狼疮疮肾炎(LN,2例Ⅳ型,2例Ⅳ+Ⅴ型)、抗肾小球基膜(GBM)肾炎、致密物沉积病、轻链沉积病(κ)及淀粉样变性(λ)各4例,感染后肾小球肾炎、膜性肾病及膜增生性肾小球肾炎各6例,IgA肾病12例。方法冰冻切片:冰冻组织切片(3μm)吹干,10%小牛血清封闭10min,分别加DAKO公司异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔多克隆抗IgG(1∶200)、IgA(1∶100)、IgM(1∶50)、C3(1∶50)、C1q(1∶50)、κ(1∶100)、λ(1∶200)抗体,室温孵育40min,流水冲洗,吹干,甘油封片,荧光显微镜观察。石蜡切片:肾活检组织经10%甲醛固定,切取1.5μm的切片,用防脱片剂(多聚赖氨酸)处理过的载玻片进行捞片,烤片。经二甲苯充分脱蜡,100%～75%梯度酒精至水,3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10min,将切片入EDTA缓冲液(pH8.0),高温高压煮沸至喷气,保温2min,自然冷却后水洗,加胃蛋白酶(Invitrogen公司)室温消化5min,PBS洗,加10%小牛血清室温孵育10min,加DAKO公司兔多克隆抗IgG、IgA、IgM、C3、C1q、κ及λ抗体,室温孵育2h,PBS洗,加FITC标记的猪抗兔IgG室温孵育30min,水洗,吹干,甘油封片,荧光显微镜观察。结果分析采用免疫荧光半定量分析,按荧光强度0分:无荧光;0.5分:荧光很弱;1分:可见荧光;2分:较强荧光;3分:强荧光。cdi平均质性表现为石蜡切片染色,无定期染色。根据检测组织石冰冻组织切片肾小球平均5个(3～8个),石蜡组织切片肾小球14个(9～26个)。冰冻和石蜡组织切片染色的平均强度分析结果见表1。石蜡切片免疫荧光染色的分布、强度与诊断用的冰冻切片染色基本一致,诊断符合率达100%(表2,图1)膜性肾病患者IgG、IgA、IgM、C3、C1q在冰冻和石蜡切片阳性染色均为颗粒状沉积于血管袢。IgA、C3、C1q在患者中的阳性比例相同。IgG和C1q染色强度一致,C3石蜡切片染色强度略弱于冰冻切片(1.5vs1.2)。冰冻切片IgM在1例患者为阳性,而石蜡切片是阴性。另1例患者IgA冰冻切片染色为0分,而石蜡切片染色为0.5分。LN患者(2例Ⅳ型,2例Ⅳ+Ⅴ型)IgG、IgA、IgM、C3、C1q在冰冻和石蜡切片分别为颗粒状沉积于系膜区(Ⅳ型)和系膜区及血管袢(Ⅳ+Ⅴ型)。1例冰冻切片C3染色为2分,而石蜡切片染色为1分,其余染色强度在两种切片无差别。IgA肾病中所有患者冰冻和石蜡切片IgA染色分布和强度均一致。C3在两种切片的染色分布一致,但石蜡切片染色强度弱于冰冻切片(1.5vs1.0)。膜增生性肾小球肾炎和抗GBM肾炎中IgG染色分布和强度均一致。冰冻切片C3染色在两种疾病中阳性比率均为66.7%(4/6),石蜡亦为66.7%(4/6),但平均染色强度也低于冰冻切片。上述几组病例中出现C3染色的不一致性,均为石蜡切片染色弱于冰冻切片,但对诊断结果无影响。链球菌感染后肾小球肾炎和致密物沉积病患者中,C3染色在两种切片均为阳性,分布也一致,染色强度石蜡切片略弱于冰冻切片,但对诊断无影响。所有患者κ、λ染色分布和强度均一致,且轻链沉积病和淀粉样变性患者石蜡切片染色部位更清晰。免疫荧光染色甲醛是最常用的固定剂,固定过程中Ca2+和其他二价离子与蛋白质形成紧密复合物封闭抗原,使这些离子螯合成沉淀是抗原热修复的关键,因而抗原修复的选择就显得很重要。常用微波炉和高压锅加热变性。微波作用于醛乙氨基的交联,使之断裂而暴露抗原决定簇。高压锅加热是抗原修复的一种简单有效的方法。同时利用EDTA与Ca2+形成螯合双价金属离子盐,消除甲醛固定产生的不利因素。高温高压比微波处理的切片染色效果好,原因是高压锅加压后可使温度达到120℃,而微波的温度100℃。组织在120℃的高温下,维持蛋白质三级结构的氨基酸侧链基团的次级链断裂,为抗体的结合提供了更多的机会,还能提高一抗稀释度。酶消化石蜡组织的优点是使细胞膜变性和打开抗原决定簇,人们尝试应用不同种类的蛋白酶进行消化。文献报道链菌蛋白酶、胰蛋白酶对肾脏病免疫复合物沉积荧光染色具有较好的效果。目前国内外肾组织石蜡切片抗原修复方法李兵等随机选取20例肾活检组织,对高温高压修复、胰酶抗原修复和无抗原修复进行比较。发现石蜡切片胰酶抗原修复组与冰冻切片免疫荧光染色结果基本符合;高温高压修复组出现较多的假阴性结果;无抗原修复组染色效果较差。董鸿瑞等选择乙肝相关的膜性肾病、LN、IgA肾病,比较微波加热、胰蛋白酶和胃蛋白酶抗原修复法的异同。结果无抗原修复基本无荧光着色,微波加热和胰酶抗原修复石蜡切片免疫荧光染色效果差,而胃蛋白酶修复效果好。两家单位得出的结论不一致,我们分别重复了两个单位的实验方法,不论用哪种方法阳性率都很低。Fogazzi等选择了10例IgA肾病、8例膜增生性肾小球肾炎和10例LN,利用链霉蛋白酶消化石蜡组织,对照了冰冻切片和石蜡切片免疫荧光染色强度,发现在不同疾病的主要免疫复合物(如IgG在膜增生性肾小球肾炎,IgA在IgA肾病,IgG和C1q在LN)免疫荧光强度出现较高的一致性。Qualman和Keren报道了52例肾活检病例,利用胰酶消化石蜡切片,发现石蜡切片与冰冻切片在IgG、IgM、IgA和fibrinogen沉积等阳性一致率达80%～90%。但高达21例石蜡切片IgG、IgM和IgA在膜增生性肾小球肾炎,IgA肾病,LN肾小球的沉积部位不同。Nasr等利用链霉蛋白酶消化石蜡组织,发现石蜡切片与冰冻切片IgA在IgA肾病沉积一致率达88%,κ和λ荧光染色与冰冻切片一致率为96%。而且κ,λ在GBM阳性表达较冰冻组织切片阳性率高而且染色强。本实验室采用的方法我们在实际工作中尝试了目前国内外的方法,结果均不满意。单独用高温修复肾组织石蜡切片,肾小球毛细血管腔内和肾小管上皮细胞常常出现非特异性着色;而单独用酶消化,阳性率很低。与已有的抗原修复方法相比,高温修复联合胃蛋白酶抗原修复法不仅能够减少肾组织非特异性背景,还能提高阳性率。对肾组织进行IgG、IgA、IgM、C3、C1q、κ和λ轻链免疫荧光染色基本达到了冰冻切片的染色效果,并且在轻链沉积病和淀粉样变性患者石蜡切片染色部位显示得更加清晰。LN、IgA肾病、膜性肾病中IgA在石蜡切片有几例强于冰冻切片,可能与免疫复合物沉积不一致有关。IgM和C3染色石蜡切片染色强度和阳性率低于冰冻切片,但不影响诊断。石蜡切片应用此方法进行免疫荧光染色取得了与诊断用冰冻组织相同的结果,因此,我们认为此方法可以作为冰冻切片无肾小球的替代方法。有报道利用高压锅热修复会导致组织破碎,尤其是小组织。长时间酶消化会使组织结构破坏,我们用防脱片剂(多聚赖氨酸)处理过的载玻片进行捞片,并且摸索抗原修复合理的温度和时间,高压锅煮的时间不能太长,喷气后2min关闭,酶消化的时间为5～8min,太短消化不足,太长容易把组织消化掉。以切片未脱落、抗原定位准确、染色清晰度和背景来判定最佳的修复方法。目前国内外石蜡切片修复后仍采用直接免疫荧光法进行染色,其特异性高,节省时间,操作简单,但敏感性差。虽然利用抗原修复方法可以暴露甲醛固定的石蜡切片中的抗原,但抗原敏感性仍较低,因此所用的荧光素标记抗体稀释倍数很低,比冰冻切片的稀释倍数要低10倍左右。而我们尝试用间接免疫荧光法进