第7讲 化学毒物的一般毒性作用

第六章化学毒物的一般毒性作用

10/24/20231§1急性毒性作用及评价§2蓄积毒性作用及评价§3亚慢性和慢性毒性作用及评价10/24/20232一般毒性（generaltoxicity）是指外源化合物在一定的接触剂量、一定的接触时间和一定的接触方式下对实验动物产生综合毒效应的能力。分类——急性毒性：acutetoxicity亚慢性毒性：subchronictoxicity慢性毒性：chronictoxicity10/24/20233§1急性毒性作用及评价一、基本概念二、急性毒性试验的目的三、急性毒性试验设计四、急性毒性评价急性毒性作用10/24/20234一、基本概念急性毒性(acutetoxicity)是指机体(人或试验动物)一次接触或24小时内多次接触化学物后在短期(最长到14天)内所发生的毒性效应，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。最主要观察指标是LD50。实验动物接触化学物的方式或途径不同，“一次”的含义也有所不同.经口和注射接触，“一次”是指在瞬间将受试化学物输入实验动物体内.经呼吸道吸入与经皮肤接触，“一次”是指在一个特定的期间内实验动物持续地接触受试化学物的过程.所以“一次”含有时间因素急性毒性作用10/24/20235一、基本概念化学物使实验动物发生中毒效应的快慢和剧烈的程度，可因所接触的化学物的质与量不同而异.有的化学物在实验动物接触致死剂量的几分钟之内，就可发生中毒症状，甚至死亡。而有的化学物则在几天后才显现中毒症状和死亡，即迟发死亡。急性毒性作用10/24/20236二、急性毒性试验目的目的①确定受试物使一种或几种实验动物死亡的剂量水平，即定出LD50，以初步估计该化学物对人类毒害的危险性。为进一步的蓄积性试验、亚慢性与慢性毒作用试验及其它特殊毒性试验的实验设计的剂量选择和毒性判断指标提供依据。②阐明一种化学物的相对毒性、作用方式和特殊毒性表现，找出其剂量一效应和剂量-反应关系，以便对一种化学物的毒性有初步的了解，包括临床症状、生理生化、病理变化及受试物的毒性性质和可能的靶器官等。③确定机体在环境中接触的受试物侵入机体的途径，研究受试物在机体内的生物转化过程及动力学变化。④研究受试物急性中毒的预防和急救治疗措施。急性毒性作用10/24/20237二、急性毒性试验目的急性毒性试验常用的毒性参数：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）LD84/LD16(或LC84／LC16)

剂量—反应曲线斜率

急性毒性作用10/24/20238三、急性毒性试验设计(一)实验动物的选择[原则]：①尽量选择急性毒性反应与人近似的动物②易于饲养，试验动物操作方便③繁殖生育力较强，数量较大能够保障供应④价格较低，易于获得动物急性毒性作用10/24/20239三、急性毒性试验设计1．动物种属选择A:首选哺乳动物,其中以大小鼠为最常用B:使用两种种属动物最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。Ｃ:不同的接触途径选择实验动物的种类有所不同．急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。急性毒性作用10/24/202310三、急性毒性试验设计⒉动物品系、性别及年龄的选择品系除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。急性毒性作用10/24/202311三、急性毒性试验设计3.禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食，以保证胃内无食物，减少食物对化学物毒性的干扰大鼠、小鼠——隔夜进食；染毒后禁食4h大动物——每日上午喂食前染毒染毒后继续禁食2~4h，但在禁食时要保障饮水。4.实验动物的预检：选择健康动物1~2周的检疫期（适应性饲养）急性毒性作用10/24/202312三、急性毒性试验设计（二）各剂量组动物数及实验动物分组在利用不同的方法测定化学物LD50时，实验设计中对动物数的要求不同4．实验动物分组和数量。对于不同的化学物测定应根据其相应的试验规程确定实验动物数量。大、小鼠等小动物每组10只狗等大动物每组6只急性毒性作用10/24/202313三、急性毒性试验设计分组原则：均衡性原则和随机化原则均衡性：要求各组动物的平均体重及体重的离散度尽可能一致。具体来说是：（1）实验动物的体重不应超过全体实验动物平均体重的20％---控制离散度；（2）每组之间的平均体重相差不应超过10％---控制均衡性。随机性：每只动物分散到各组去的机会是均等的，以避免成见或系统误差。急性毒性作用10/24/202314三、急性毒性试验设计（三）实验动物喂养环境恒定的温度：22±3℃湿度：30~70%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格急性毒性作用10/24/202315三、急性毒性试验设计（四）剂量选择与剂量分组:急性毒性试验的重要目的是测定LD50，欲求一个未知毒性的受试物的LD50，必须设计好分组数与染毒剂量，这往往需要通过预实验来确定。

急性毒性作用10/24/202316三、急性毒性试验设计

1．查阅文献①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50值作为受试化学物的预期毒性中值。但应注意，一定是相同动物种系和相同接触途径。急性毒性作用10/24/202317三、急性毒性试验设计2．预试验

①设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l-2个剂量组作为预试验剂量。②根据确定的剂量组进行染毒。③根据预试验的死亡资料确定组距。急性毒性作用10/24/202318三、急性毒性试验设计（四）剂量选择与剂量分组:3．正式试验设置几个剂量组较为合适，取决于预备实验的结果,即根据LD0(或LD10)与LD100(或LD90)之间剂量相差的多少决定。相差的多，可适当增加组数，反之可适当减少组数。组数的确定还要考虑计算LD50的方法。如使用几率单位法、寇氏法计算，一般设置4-6个剂量组，并按下式计算组距：

i=(LD90-LD10)／(n-1)或：i=(LD100-LD0)／(n-1)式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数使用霍恩法计算，则固定设4个剂量组，组距可分别定为2.15倍或3.16倍求得i值后．以最低剂量组(LD0或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值

123456LgLD0LgLD0+iLgLD0+2iLgLD0+3iLgLD0+4i•••急性毒性作用10/24/202319三、急性毒性试验设计（五）实验动物染毒方法

染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：(1)模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；(2)有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；(3)受试物的性质和用途；(4)各种受试物毒性评价程序的要求等。

最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。

急性毒性作用10/24/202320三、急性毒性试验设计经口(胃肠道)接触:灌胃:空腹灌胃后2-3h复食灌胃的体积不超过体重的1-2％：小鼠0.2

1.0ml/只或0.1

0.5ml/10g大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kg狗不超过50ml/10kg

掺入饲料法：吞咽胶囊:

一般来说新物质均先进行经口染毒途径的急性毒性试验,求出LD50值,通常用该LD50值来比较不同化学物急性毒性大小

急性毒性作用10/24/202321三、急性毒性试验设计经呼吸道接触:

在常温、常压下为气态，或在生产过程中和生活过程中以蒸气、气溶胶、烟、粉尘状态污染生产与生活环境空气，此时就有可能经呼吸道吸入。吸入接触分为两种方式：静式吸入；动式吸入经皮肤接触:研究外源化学物经皮肤吸收应当尽量选择皮肤解剖、生理与人类较近似的动物为对象，目前多选用家兔和豚鼠。但由于研究化学物经皮肤吸收的毒性(求经皮LD50)所需的实验动物较多，使用家兔、豚鼠不够经济，也常用大鼠代替。急性毒性作用10/24/20232210/24/202323三、急性毒性试验设计（六）试验周期测定外源化学物的LD50(LC50)，一般要求计算实验动物接触化学物之后两周（14天）内的总死亡数。对于一些速死性化学物求其LD50(LC50)也可仅计算24小时的死亡率。有些速杀性化学物的24小时LD50与两周LD50值往往没有差别。但应注明是多少时间的LD50值，以便于在进行毒性比较时有共同的基础急性毒性作用10/24/202324三、急性毒性试验设计（七）观察指标观察染毒后实验动物的中毒表现，对于了解受试物的急性毒作用特征非常重要，可以弥补单纯以LD50(LC50)表示化学毒物急性毒性的局限性，还有助于估测毒作用的靶器官。急性毒性试验的观察和记录内容主要包括:①中毒体征及发生过程②死亡情况和时间分布③体重④病理检查1.致死剂量或浓度急性毒性作用10/24/202325三、急性毒性试验设计（七）观察指标2.症状观察、病理学检查和其他指标观察（1）中毒症状急性毒性作用10/24/202326三、急性毒性试验设计（五）试验周期与毒效应观察（2）死亡和死亡时间重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。

急性毒性作用10/24/202327三、急性毒性试验设计（五）试验周期与毒效应观察:

（3）体重在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物．应在观察期14天内称量其体重的变化．以便了解受试物引起毒效应的持续时间。在观察期间应注意观察其体重变化。这有助于了解受试化学物所致的中毒效应是短暂的或较长期的效应。急性毒性作用10/24/202328三、急性毒性试验设计（五）试验周期与毒效应观察:（4）病理检查及其他指标:急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查．必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。应当重视病理组织学检查➢凡中毒死亡动物应及时解剖做病理学检查，检查器官有无充血、出血、水肿或其它改变，并对有变化的脏器作病理组织学检查➢对存活动物于观察期结束后应做病理学检查急性毒性作用10/24/202329三、急性毒性试验设计(六)经典急性毒性试验的局限性1.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。急性毒性作用10/24/202330四、急性毒性评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250实际无毒5000~10000~2180~>15>1000急性毒性作用不论我国或国际上的急性毒性分级标准均还存在不少缺点，因为它们主要是根据经验确定，客观性还不足。目前还没有全世界公认、统一的毒性分级标准。10/24/202331四、急性毒性评价我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)<1稍尝,<7滴5级(剧毒)1~507滴~1茶匙4级(中等毒)51~5001茶匙~35克3级(低毒)501~500035~350克2级(实际无毒)5001~15000350~1050克1级(无毒)>15000>1050克急性毒性作用10/24/202332附：LD50的计算方法LD50的计算方法很多，其中较常用的有寇氏法概率单位-对数图解法霍恩法

10/24/202333一、基本概念二、

蓄积毒性试验方法及其评价蓄积作用及其评价§2蓄积毒性10/24/202334大多数外来化学物进入机体后，经过复杂的生物转化和生物转运过程，最后将从体内消除。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。

蓄积作用及其评价一、基本概念10/24/202335

蓄积作用实际上有二个含义：

物质蓄积：当化学物进入机体后，在体内消除的数量少于输入的数量，导致该化学物或其代谢产物在体内的储留量逐渐增加。

功能蓄积：化学物进入机体后虽然贮存在体内的物质或其代谢产物的数量极微，甚至不能检出，但是会引起机体的功能或形态结构发生一定程度的改变；或者是由于每次机体接触化学物之后所引起的损害累积所致。蓄积作用是发生慢性、亚慢性中毒的物质基础。一种外源化学物有无蓄积作用是评定该化学物是否可能引起潜在慢性中毒的论据之一，也是制定卫生限量标准。时安全系数的一种依据。蓄积作用及其评价一、基本概念10/24/202336二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积毒性试验是检测外来化合物蓄积性大小的试验，通过蓄积试验可以了解一种外来化合物在体内的蓄积情况和程度，并可为慢性毒性试验进行准备。蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。蓄积作用及其评价10/24/202337二、蓄积毒性试验方法及其评价蓄积作用的检测有两类方法：理化方法：应用化学分析或其他技术测定化学物进入机体以后，在体内含量变化的过程。该方法可确定化学物的半减期，故可作为检测物质蓄积的方法。生物学方法：即将多次染毒与一次染毒所产生的生物学效应进行比较，故所测出的蓄积性不能区分功能蓄积和物质蓄积。蓄积作用及其评价10/24/202338(一)蓄积系数法

原理：在一定期限之内以低于致死剂量(小于LD50剂量)，每日给予实验动物，直至出现预计的毒性效应(或死亡)为止。计算达到预计效应的总累积剂量，求出此累积剂量与一次接触该化学物产生相同效应的剂量的比值，此比值即为蓄积系数(K值):K=ED50(n）/ED50(1)蓄积作用试验多用小鼠或大鼠为实验动物，一般以死亡为指标，其K值计算公式如下：K=LD50(n）/LD50(1)LD50(n)表示引起一半动物死亡的累积总剂LD50(1)表示引起一半动物死亡的一次剂量意义：K值越小，表示化学物的蓄积毒性越大虽然蓄积系数法具有一定使用价值，但是某些外源化学物的慢性中毒效应，无法用K值表示.例如多数有机磷化合物是属于轻度蓄积(K>5)，但当小剂量反复与机体接触后，红细胞与脑组织的乙酰胆碱酯酶可以持续降低，而且伴有一定程度的中枢神经系统症候虽然蓄积系数法具有一定