高三生物2010.07.23选三1.2基因工程基本操作程序

主要内容：（一）基因工程的概念（二）基因操作的工具（三）基因操作的基本步骤（四）基因工程的发展（五）基因工程的安全性基因工程别称操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外和体内基因DNA分子水平转基因生物、基因产物剪切→拼接→导入→表达实质：基因重组复习：基因工程的概念普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因构建基因表达载体棉花细胞棉花植株(有抗虫特性)上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？抗虫基因表达1234以基因工程培育“抗虫棉”的过程为例：(含抗虫基因)导入组培基因工程培育抗虫棉的关键步骤：1.获取苏云金芽孢杆菌的抗虫基因2.抗虫基因与运载体DNA连接3.抗虫基因导入受体(棉花)细胞4.检测抗虫基因是否导入、鉴定其是否表达分子手术刀——限制性内切酶分子缝合针——DNA连接酶分子运输车——运载体解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？1.1 DNA重组技术的工具1）来源：2）作用特点：3）功能：4）作用结果：5）举例： 主要是原核生物中分离纯化特异性识别、切割 黏性末端、或平末端1.1.1分子手术刀——限制性内切酶

（简称限制酶）例：EcoRⅠ能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。识别特定序列（回文序列）、在特定位点切割限制酶2个黏性末端彼此间正好互补配对的切口要切2个切口，产生4个黏性末端。非编码区非编码区目的基因要想获得“某个特定性状的基因”必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？编码区1.会出现相同的黏性末端如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？2.然后让两者的黏性末端的碱基互补配对，就似乎可以合成重组的DNA分子了。如果用不同的限制性内切酶切割，还会顺利形成重组DNA分子么？为什么？1.1.2 DNA连接酶——分子缝合针磷酸二酯键（扶手），而非氢键（踏板）两个相同的黏性末端的连接、或使平末端相连形成磷酸二酯键用DNA连接酶连接两个相同的黏性末端，需要连接几个位点？1）连接部位：

2）结果：ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATACTATCGTACGATATTTACTTAAGCCGTATGTCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATACAGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG1）最常用载体：2）必备的条件：①②③3）其他常用种类1.1.3 基因进入受体细胞的（运）载体

——分子运输车天然质粒普遍同时具有以上三个条件吗？目的基因运载体同种限制酶基因表达载体受体细胞（广东生物7）现有一长度为1000碱基对（by）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoR1酶切后得到的DNA分子仍是1000by，用Kpn1单独酶切得到400by和600by两种长度的DNA分子，用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200by和600by两种长度的DNA分子。该DNA分子的酶切图谱正确的是（）D（天津卷30）下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①～⑦表示基因的不同功能区。据图回答：⑴上述分子杂交的原理是

；细胞中β-珠蛋白基因编码区不能被翻译的序列是图中

，为该基因_____区上的_______序列。⑵细胞中β-珠蛋白基因开始转录时，能识别和结合①中调控序列的酶是

。⑶若一个卵原细胞的一条染色体上，β-珠蛋白基因编码区中一个A替换成T，则由该卵原细胞产生的卵细胞携带该突变基因的概率是

。⑷上述突变基因的两个携带者婚配，其后代中含该突变基因的概率是

。1.获取目的基因2.基因表达载体的构建3.将目的基因导入受体细胞4.目的基因的检测和鉴定1.2 基因工程的基本操作程序1）目的基因：能编码特定蛋白质的结构基因。如：苏云金芽孢杆菌的抗虫基因 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因 种子贮藏蛋白的基因 人的胰岛素基因、干扰素基因……1.2.1 获取目的基因①从基因文库中提取②人工合成基因：已知氨基酸序列合成基因2）目的基因的提取方法包括：基因组文库＞cDNA文库生物DNA经限制性内切酶切割得到提取mRNA经反转录得到③利用PCR技术扩增

目的基因用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（即扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再利用一定发方法将目的基因的DNA片段分离出来。①鸟枪法（散弹射击法）：生物体中提取出现成的mRNA单链DNA双链DNA(cDNA)反转录合成②反转录法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的脱氧核苷酸序列推测推测目的基因化学合成此方法合成的目的基因与真实基因一样吗？有何差别？只含外显子和部分已知的非编码区因同义密码子有很多，所以mRNA有多种可能③人工合成目的基因法：利用PCR技术扩增目的基因概念体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。特点短时间扩增目的基因。原理

DNA半保留复制原理。条件目的基因序列、引物、Taq酶、脱氧核苷酸、温度、pH等1.2.2 基因表达载体的构建（核心）（1）基因表达载体的组成

目的基因、启动子、终止子、标记基因等RNA聚合酶识别、结合的位点如何才能把这些序列连接在一起？（2）构建工具：同种限制性内切酶、DNA连接酶目的基因与运载体结合的结果可能有几种情况？目的基因与目的基因结合；运载体与运载体结合；目的基因与运载体结合√思考：可以被筛选出来实质：不同来源的基因进行重组质粒含目的基因的DNA分子限制性内切酶一个切口，两个黏性末端两个切口，获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种（1）导入植物细胞（受精卵或体细胞）农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法其T-DNA可将目的基因整合到受体细胞的染色体DNA上1.2.3 将目的基因导入受体细胞经组培，得到

转基因植物基因枪法：

10000个整合细胞/枪 气压300-600米/秒

脱氧核糖核酸随机插入，原理不明1987年，周光宇中国的转基因棉花原理不明显微注射法如何才能知道含有目的基因的运载体是否成功导入受体细胞？（2）导入动物细胞 ？经胚胎移植，得到转基因动物（受精卵为主）Ca2+处理，形成感受态细胞如何才能知道含有目的基因的运载体是否成功导入受体细胞？（3）导入细菌细胞——繁殖快经微生物培养，得到工程菌能吸收周围环境中的DNA四环素抗性基因青霉素抗性基因如何通过检测受体细胞中运载体上标记基因的表达，确定连锁的目的基因是否导入？对于这个重组质粒，该如何检测它是否被导入受体细胞？目