高效液相色谱法同时测定25批蜘蛛香中5种有效成分

高效液相色谱法同时测定25批蜘蛛香中5种有效成分

蜘蛛香是蔷薇科植物的蜘蛛根和根茎。具有理气、止痛、消食、除湿、镇静人心等功效。《中国药典》(2010年版)规定蜘蛛香以其中的缬草三酯和乙酰缬草三酯作为指标成分进行含量测定。然而,根据文献报道及课题组前期研究显示,缬草素类成分并不非常稳定,故可以选择更为稳定的成分作为含量测定指标对药材进行质量控制。为了保证蜘蛛香的质量,本实验在课题组对其化学成分研究的基础上,选择了含量较高、稳定性较好且具有多种药理活性的3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为质量控制指标,建立以高效液相色谱法同时测定该3种活性成分含量的方法,并以统计分析软件“TheUnscramblerX10.1”对25批蜘蛛香药材的含量测定结果进行聚类分析,旨在提升该药材的质量控制,并为其合理开发利用提供一定的实验及理论依据。1仪器和试剂盒1.1柱温箱、紫外分离器Agilent1100高效液相色谱仪(四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、Chemstation色谱工作站)(美国安捷伦公司);MettlerAE240电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司);超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)等。1.2测定试剂及仪器3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品(自制,HPLC峰面积归一化法测定纯度均大于98%),乙腈为色谱纯,水为超纯水,其余试剂均为分析纯。实验所用25批贵州蜘蛛香药材,均由贵阳医学院龙庆德副教授鉴定均为败酱草科缬草属蜘蛛香(ValerianajatamansiJones)的干燥根茎及根。2方法和结果2.1量表1:3-o-咖啡酰基奎宁酸溶液色谱柱:PhenomenexGeminiC18(4.6mm×250mm,5μm);流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),梯度洗脱:0~16min,6%~20%A;16~21min,20%~23.5%A;21~30min,23.5%A;30~35min,23.5%~32%A;检测波长:340nm;柱温:25℃;流速:1.0mL·min-1;进样量:10μL。在此条件下,理论板数按3-O-咖啡酰基奎宁酸计应不低于10000,供试品中3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分离度均大于1.5。对照品和供试品溶液的色谱图,见图1。2.2对照品溶液的制备称取3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸对照品适量,精密称定,加体积分数50%乙醇溶液制成每1mL分别含3-O-咖啡酰基奎宁酸0.165mg,橙皮苷0.570mg,4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸0.055mg的混合对照品溶液,即得。2.3提取减失液制备取蜘蛛香药材粉末(过40目筛)约0.25g,精密称定,精密加入体积分数50%乙醇25mL,称定重量,加热回流提取1.5h,放冷,再称定重量,用体积分数50%乙醇补足减失的重量,摇匀,滤过,取续滤液,高速离心10min(10000r·min-1),取上清液,即得。2.4-o-咖啡酰基奎宁酸标准精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液2,4,6,8,10,12μL依次进样,按“2.1”项下条件进测定。以峰面积为纵坐标(Y),进样量(μg)为横坐标(X),计算回归方程。3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸的回归方程分别为Y=2475.90X-23.85(r=0.9999)、Y=316.33X-16.93(r=0.9999)、Y=3243.82X-14.72(r=0.9999)。结果表明,3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸分别在0.33~1.97μg、1.14~6.84μg、0.11~0.66μg呈良好的线性关系。2.5进样峰面积测定精密吸取按“2.3”项下方法制备的供试品溶液10μL注入液相色谱仪,连续进样6次,测定峰面积。结果3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为1.1%,1.8%,0.8%,表明在此条件下仪器精密度良好。2.6复配体系中各组分含量的rsd取同一批号蜘蛛香药材粉末,按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项条件测定,并计算各成分含量的RSD。结果3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量的RSD分别为0.8%,1.6%,1.2%,表明该方法的重复性良好。2.7进样测定条件精密吸取同一供试品溶液10μL,分别于0,1,2,4,8,12h进样,按“2.1”项条件测定。结果3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸峰面积的RSD分别为1.8%,0.9%,1.1%,说明供试品溶液在12h内稳定。2.8加样回收率试验精密称取已知含量(含3-O-咖啡酰基奎宁酸7.49mg·g-1、橙皮苷31.20mg·g-1、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸3.22mg·g-1)的同一批次药材粉末6份,每份约0.125g,分别精密加入混合对照品溶液25mL(含3-O-咖啡酰基奎宁酸0.0375mg·mL-1、橙皮苷0.1560mg·mL-1、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸0.0161mg·mL-1),按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1”项下条件测定含量,计算回收率及其RSD,结果见表1。3样品测定分别取不同产地蜘蛛香药材,按“2.3”项下方法平行制备2份供试品溶液,按“2.1”项下条件测定,结果见表2。4聚类分析结果分别取不同产地(批次)蜘蛛香药材的含量测定结果进行聚类分析。以样品中3种活性成分含量作为指标进行聚类分析,采用TheUnscramblerX10.1统计软件的离差平方和法(Ward法),选取欧氏距离平方(squaredEuclideandistance)作为样品测度,对25批样品进行系统聚类分析,绘出树状图,结果见图2。根据聚类分析结果,在距离4内可将25批样品分为3类:第一类有10批药材,即S3、S6~S7、S9、S12~S14、S19~S21,此类样品中3-O-咖啡酰基奎宁酸含量较高,而橙皮苷含量偏低,导致此类样品中3种被测成分总含量均低于平均值;第二类有10批药材,即S1~S2、S4~S5、S8、S15、S22~S25,此类样品中3种被测成分各含量较均衡,与平均值无较大差异;第三类有5批药材,即S10~S11、S16~S18,此类样品中被测3种成分的总含量较高,且橙皮苷含量远高于其他样品,结果见表3。5检测波长的选择及提取方法的确定近年来,蜘蛛香的相关报道很多,但在其质量控制方面却仍不完善,缬草素类成分不耐热、易酸水解,而采用文献报道橙皮苷单一指标的含量测定又不能完全反应蜘蛛香的整体情况,这限制了蜘蛛香及其制剂的进一步开发。故本实验在课题组前期对蜘蛛香化学成分研究的基础上,选择了其中较稳定的3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为指标成分,该3种成分具有抗炎、抗氧化、抗菌抗病毒等药理活性,该含量测定方法能够用于蜘蛛香药材的质量控制。实验采用二极管阵列检测器检测在190~400nm之间对待测成分进行紫外扫描,结果在340nm进样测定时,基线平稳、分离较好且峰形对称,故选择340nm作为检测波长。由于所测定的成分极性相差较大,故采用梯度洗脱,且结果表明,乙腈-水的分离效果比甲醇-水的分离效果好;而橙皮苷和奎宁酸类化合物均含有酚羟基,以有机溶剂-水为流动相,色谱峰峰形不佳,故实验选用乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。实验对供试品的制备方法进行了考察,比较了不同提取方式(回流提取2h、超声提取30min、索式提取4h)、不同提取溶剂(甲醇、体积分数70%甲醇、体积分数50%甲醇、乙醇、体积分数70%乙醇、体积分数50%乙醇)以及不同提取时间(0.5、1、1.5、2、4、6h)。结果表明,采用回流提取方法,以体积分数50%乙醇作为提取溶剂,提取1.5h,被测成分提取基本完全,且提取效率较高。本实验以3-O-咖啡酰基奎宁酸、橙皮苷和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸作为指标成分对贵州地区蜘蛛香药材进行测定,其中3-O-咖啡酰基奎宁酸和4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸为课题组前期研究中首次分离得到的化合物,橙皮苷测定结果与文献报道基