固相微萃取法与水气蒸馏法提取蜘蛛香挥发油成分比较

固相微萃取法与水气蒸馏法提取蜘蛛香挥发油成分比较

蜘蛛香是艾蒿科的一种植物。主要产于四川、贵阳等地。药品的位置是参考书目的根，最初写在《本草纲目》中，并于1977年版《中国药典》中收集。蜘蛛香的化学成分包括挥发油、环烯醚萜类、黄酮类和酚酸类化合物,其中蜘蛛香挥发油具有理气止痛、消炎止泻、祛风除湿的功效,是蜘蛛香的药效成分。关于蜘蛛香挥发油的研究已有报道,文献多采用水蒸气蒸馏(SD)法,但该方法所需时间长、样品需求量大。在前期工作中,笔者采用固相微萃取(SPME)技术对多种药用植物进行研究,建立了稳定、快速和准确的分析方法[5~8]。本文分别采用SPME法和SD法提取蜘蛛香挥发油,并比较其成分差异,旨在为药材检测提供一种新的简便、快速的方法。1材料表面1.1spme进样器和萃取头6890N型气相色谱(GC)-5975型质谱(MS)联用仪(美国安捷伦公司);手动SPME进样器和65μm聚二甲基硅氧烷(PDMS-DVB)萃取头(美国Supelco公司);AL104型电子分析天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)。1.2国外药药:valesianajatmanswell,c62c6蜘蛛香根茎于2006年8月采集于贵阳,由贵阳中医学院刘凡副教授鉴定为ValerianajatamansJones,标本存于河南大学天然药物研究所;C6~C26正构烷烃(AlfaAesar);其它试剂均为分析纯。2方法和结果2.1提取蜘蛛香的两种方法2.1.1体积流量的确定SPME的萃取纤维头在GC的进样口以250℃老化10min,载气体积流量为1.0mL·min-1。取阴干的蜘蛛香根茎0.7g,置于5mL样品瓶中,插入65μmPDMS萃取纤维头,于80℃顶空取样,30min后取出,立即插入色谱仪(250℃),脱附1min。2.1.2特殊气味油物的制备取蜘蛛香根茎50.0g,切碎,置于500mL圆底烧瓶中,常压水蒸气蒸馏6h,用乙醚萃取2次,除去乙醚,用无水硫酸钠除去水分,过滤,获得具有特殊气味的浅黄色油状物,得率为0.14%。2.2wo-ms条件2.2.1色谱条件升温(1)GC条件。HP-5MS石英弹性毛细管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm),载气为高纯氦气(99.999%),流速为1.0mL·min-1,进样口温度为250℃,升温程序为色谱柱初始温度50℃(保持1.0min),以3℃·min-1升温至120℃(保持2min),最后以4℃·min-1升温至210℃(保持10min)。(2)MS条件。电子轰击(EI)电离源,电离能量为70eV,离子源温度为250℃,传输线温度为280℃,四级杆温度为150℃,电子倍增器电压为1765V,质量扫描范围为30~440amu,不分流进样。2.2.2色谱条件升温(1)GC条件。HP-5MS石英弹性毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm),载气为高纯氦气(99.999%),流速为1.0mL·min-1,进样口温度为250℃,升温程序为色谱柱初始温度60℃(保持2.0min),以4℃·min-1升温至120℃(保持2min),最后以2℃·min-1升温至210℃(保持5min)。(2)MS条件。电子轰击(EI)电离源,电离能量为70eV,离子源温度为250℃,传输线温度为280℃,四级杆温度为150℃,电子倍增器电压为1765V,质量扫描范围为30~440amu,不分流进样,进样量为1μL。2.3萃取方法的选择科瓦茨(Kovats)保留指数(KI)是化学物质在相应类型分离柱中对应正构烷烃的一种比较稳定的性质。只要用于分离的色谱柱性质相同、GC条件相近,同种组分在不同仪器上计算出来的KI值通常为常数。因此,同时考虑分离峰的MS匹配度和KI匹配度可大大提高鉴定结果的准确性。在芳香精油复杂组分鉴定中,该方法在国际上得到普遍认可并得到大量使用。具体测定方法:将色谱正构烷烃样品(C6~C26)各取等量混合后,分别按上述GC条件进行色谱分析,测定各正构烷烃的保留时间,然后在完全相同的条件下,对挥发油样品进行分析,测定各组分的保留时间,再根据下述线性升温保留指数计算公式计算出各组分的KI:KI=100n+100[tR(x)—tR(n)]/[tR(n+1)—tR(n)]。式中,KI为Kovats保留指数;tR为被测组分的保留时间;下标x为被测组分符号;下标n和n+1为分别具有n和n+1个碳原子的正构烷烃符号。2.4芳基-1,7,7,7,7,7,7,5,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,5,7,7,7,7,7,5,7,7,7,7,5,7,7,7,5,7,7,7,5,7,7,7,5,7,7,7,5,7,5,7,5,7,7,5,7,5,7,7,5,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,5,7,7,5,7,7,7,5,7,5,7,7,7,7,7,5,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,5,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7,7将“2.1.1”项下样品在GC进样口处脱附1min后,照“2.2.1”项下条件进行测定,结果见表1。将“2.1.2”项下样品照“2.2.2”项下条件进行测定,结果见表1。由表1可知,SPME法提取物中共鉴定出29种成分,包括较多的挥发性成分,其中含量较高的是:[1S-(1α,7α,8aβ)]-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-甘菊环(17.08%)、[1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]-1a,2,3,4,4a,5,6,7b-八氢-1,1,4,7-四甲基-1H-环丙烷[e]甘菊环(13.76%)、[1S-(1α,4α,7α)]-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-甘菊环(13.50%)、α.-石竹烯(7.41%)、3-甲基丁酸(6.89%)。SD法提取物中共鉴定出了12种成分,其中含量较高的是:3-甲基丁酸(54.46%)、广霍香醇(12.36%)、3-甲基戊酸(5.89%)、[1S-(1α,7α,8aβ)]-1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-1,4-二甲基-7-(1-甲基乙烯基)-甘菊环(5.59%)。3从spme法总体上看药材质量与SD法提取得到的挥发油成分相比,SPME法提取得到的挥发油中,不仅含有SD法得到的挥发油的主要成分3-甲基丁酸和广藿香醇,且甘菊环类化合物含量明显增高;而且提取出了SD法没有得到的19种成分,如:α-石竹烯、十氢-香木兰烯以及一系列萘衍生物等。仅有3-甲基戊酸和(1α,3aα,7α,8aβ)-2,3,6,7,8,8a-六氢-1,4,9,9-四甲基-1H-3a,7-甲氧基甘菊环这2种成分在SPME法提取得到的挥发油中没有被检测到。甘菊环类化合物是生药母菊的有效成分,在治疗胃炎和胃溃疡方面效果较好,也可用于治疗阴道炎、肌肉疼痛和痤疮等;石竹烯是毛大丁草根中分离筛选出的有良好止咳化痰活性的成分之一,提示甘菊环类化合物和石竹烯可能是蜘蛛香理气止痛功效的活性成分。由此可见,SPME法比SD法更全面地评价了蜘蛛香的药材质量。与传统的样品前处理方法如液-液萃取、索氏萃取、层析、蒸馏、吸附等相比,SPME技术具有明显的优越性。传统处理方法普遍具有大量使用有机溶剂、处理时间长(一般需3~6h)、操作步骤多的缺点,容易损失样品,产生较大误差,且溶剂的大量使用会影响操作人员健康、污染周围环境。而SPME技术集采样、萃取、浓缩、进样为一体,所需时间大大缩短,一般只需0.5~1h,而且对样品有很强的富集作用,可以大大提高分析灵敏度。SPME法最突出的特点在于,它是真正的无溶剂、纯“绿色”的样品前处理技术,装置便于携带,操作简单,操作成本低廉,适于推广应用,