抗肿瘤血管生成的靶点药物联合应用进展

抗肿瘤血管生成的靶点药物联合应用进展

血管生成是指现有的血管网络通过“发芽”或“分化”而生长的新血管网络。多年以来,它被认为是肿瘤新生血管形成(Neovascularization)或血管化(Vascularization)的唯一方式。然而,随着近年对肿瘤血管生成研究的不断深入,学者发现,除了出芽式血管生成(Sproutingangiogenesis)外,肿瘤新生血管形成过程还有其他方式,包括:套入式血管生成(Intussusceptiveangiogenesis)、募集而来的内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells,EPCs)形成血管的血管发生(Vasculogenesis)、血管共选择(Vesselco-option)、血管生成拟态(Vasculogenicmimicry)以及淋巴管生成(Lymphangiogenesis)等。由于与肿瘤血管抑制治疗关系密切,这些特殊的肿瘤血管生成方式一经被鉴定便引起了人们的广泛关注与极大兴趣。随着对这些血管生成方式研究的深入,必将为肿瘤的临床诊断及治疗提供新的方法和策略。1血管生成的调控因素出芽式血管生成是人们研究最多、相对最清楚的肿瘤血管新生方式,即是指在原有微血管的基础上通过“芽生”的方式形成的新生毛细血管。它对于肿瘤原发灶、转移灶的生长都具有重要的作用。肿瘤血管生成涉及内皮细胞(Endothelialcells,ECs)、外膜细胞、血管生长因子及细胞外基质(ECM)等,包括ECs激活、ECM降解、ECs增殖移行、管腔结构形成及血管外膜形成等,其中ECs的增殖和移行是血管生成的关键步骤。Brooks将血管生成分为三个阶段:启动阶段、侵袭/增殖阶段和成熟阶段。在这些阶段中,ECs首先发生表型变化,在生长因子等作用下大量增殖,借助细胞表面的粘附分子(Adhesionmolecules,AM),ECs之间相互粘附并与ECM粘附,以构建并扩充新生微血管。其大致过程如下:在血管生成之初,血管高度扩张,通透性显著增加,内皮细胞退缩,细胞间连接数量减少,在血管出芽部位,内皮细胞活化并释放纤溶酶原激活物、基质金属蛋白酶等多种蛋白水解酶,引起基底膜降解。基底膜的降解,增加了内皮细胞活动的自由度,内皮细胞从血管壁脱离,向刺激源作定向移动。迁移的内皮细胞,在特异性血管生成因子的作用下活跃增殖,并排列成内皮细胞束。内皮细胞卷曲并相互连接形成血管腔,同时新合成的基底膜成分沉积在内皮细胞周围,周细胞出现,阻止内皮细胞进一步增殖。此时形成的血管非常脆弱,极易破裂出血,通透性也较高,需要进一步的重塑才能成为成熟血管。出芽式血管生成受多种调节因素的影响,包括肿瘤细胞、巨噬细胞、ECs和基质细胞等所表达的调控因子及神经内分泌因素等。肿瘤生长至1.0-2.0mm3,血管生成刺激因素超过抑制因素时,如缺氧(Hypoxia)状态使缺氧诱导因子(Hypoxiainduciblefactor,HIF)表达增强,促进各类促血管生长因子的表达上调等,活化ECs,启动血管生成;肿瘤细胞、基质细胞或活化的ECs等分泌出其他血管生成所需要的蛋白酶如基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases,MMPs)、胶原酶、血浆酶原激活物及血管渗透因子等,降解基底膜和细胞外基质,使内皮细胞呈游离态,游离内皮细胞移出血管、向着肿瘤等分泌的刺激因子迁移;ECs通过与粘附分子粘附、细胞运动等进行迁移过程中,一边破坏前端的基底膜,一边开始形成血管的雏形;ECs在刺激因素作用下进行增殖;随后,迁移中的ECs逐渐伸长,沟通成管,形成新的管腔,这些未成熟的血管进一步形成血管分支和血管网,内皮细胞重新排列组合成条索状,形成新的血管,同时分泌抗血管生成物质,使新生血管稳定成熟;最后,刺激成纤维细胞分泌细胞外基质,在新生血管腔周围基底膜成分不断沉积,并形成起支持作用的外膜细胞后,毛细血管网才真正成熟。在这个过程中,肿瘤细胞、基质细胞等分泌血管生长因子诱导血管生成,新生血管除了提供营养支持外,ECs还能合成生长因子通过旁分泌作用影响ECs和肿瘤细胞,进一步促进血管生成。因此,ECs和肿瘤细胞相互刺激而生长,促使肿瘤不断发展演变乃至发生转移。总之,出芽式血管生成是一个极其复杂的过程,已发现大量的调节因子参与其中,而VEGF/VEGFR-2是最重要的调控分子,下文中将深入探讨相关的调控机制。2血管生成和vegf在肿瘤组织内的表达是受Caduff于1986年首次发现套入式血管生成(Intussusceptiveangiogenesis)的现象,它是一种与出芽式血管生成完全不同的肿瘤血管生成方式,不需要内皮细胞出芽,指已有的毛细血管呈柱状插入管腔,在血管腔内形成套入式微柱的血管生成,其关键环节是跨血管管腔微柱的形成。出芽式血管生成形成原始毛细血管丛,而套入式血管生成主要在血管的生长及血管床的发育、血管的重塑和修剪等过程中发挥作用,能量消耗少。根据微柱出现的位置、时间和频率的不同,套入式血管生成可分为套入式微血管生长、套入式树枝状分枝及套入式分支重塑等不同方式。套入式血管生成的一个重要特征是在血管生成过程中,内皮细胞的数目增加很少,而血管腔内却出现了大量的微柱,其内皮细胞分散变薄、表面积增大,覆盖在微柱表面。这种血管生成方式不以大范围的内皮细胞增殖、基底膜降解以及侵周围组织为基础,而是通过已有的血管管腔内形成大量的跨血管组织微柱使毛细血管在自身基础上扩张。由于不需要内皮细胞的增殖,这一过程在几小时甚至几分钟内就会出现。而出芽式血管生成是一个较为迟缓的过程,至少需要24h,到整合入脉管系统并形成有灌注功能的新毛细血管网需要3-5d。套入式血管生成是肿瘤血管生成的另一个重要方式。直径小于8mm的肿瘤中以出芽式血管生成为主,而体积大的肿瘤组织内这两种血管生成方式同时存在。目前对于套入式血管生成的分子调控机制尚不十分清楚,可能与血管生成素及其Tie受体、PDGF-B(Plateletderivedgrowthfactor-B)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocytechemotacticprotein-1)、Ephrins及EphB受体等分子有关。有研究提示,PDGF-B、VEGF-A、ANG-1可能对套入式血管生成有促进作用。也有研究提示,VEGF主要表达分布在以出芽式血管生成为主的肿瘤周边部,而以套入式血管生成为主要方式的肿瘤部位VEGF表达呈阴性,且相邻肿瘤组织中VEGF表达水平也可能不同,这主要与肿瘤组织内存在套入式血管生成有关。据此推测,在肿瘤生长早期由于局部缺氧以出芽方式为主,而在晚期由于肿瘤需要更高的血管密度,肿瘤内部的血管生成转为以套入式血管生成为主。而抑制出芽式血管生成有可能会激活套入式血管生成过程,这可能是抗血管生成药物产生耐药性的一种机制。由于套入式血管生成过程中无需内皮细胞的增殖,而目前临床上治疗肿瘤常用的化学药物主要是针对分裂期细胞,虽可抑制出芽式血管生成,但对套入式血管生成难以凑效,这对肿瘤的抗血管生成治疗提出了新的问题,需要开发抑制细胞迁移运动功能的新药。3epc与肿瘤骨髓含有一群能迁移到外周血并分化为成熟内皮细胞的祖细胞,即为血管内皮祖细胞(EPCs)。越来越多的证据显示,EPC不仅参与生理性血管形成,还在多种病理状态下被动员出骨髓归巢至靶组织,增强代偿性血管重建,并参与肿瘤新血管形成。EPC和造血干细胞具有许多共同的细胞表面标记,如血管内皮生长因子受体-2(VEGFreceptor-2、VEGFR-2/Flk-1/KDR)、Tie-2和CD34等,它们可能起源于共同的前体细胞。而CD133是早期EPC特异性标志,Flk-1、PECAM和Tie-2、VE-Cadherin和Tie-1按顺序依次表达,细胞逐步获得内皮标记,同时其干细胞特性渐弱,晚期EPC逐渐丢失CD133,这可能反映了循环EPC向成熟内皮样细胞的转化,成熟EC不表达CD133。正常情况下,EPC的数量极少,出生后主要位于骨髓中,而脐带血、胎肝和外周血也能分离出EPC。研究显示,循环EPC被募集至机体特定部位、增殖分化并参与新生血管的发育,也是一种新生血管形成的重要方式,新生血管中约25%的内皮细胞由EPC增殖分化而来。最近报道,成人血管壁上有EPC存在的特定区域,该区域的EPC也能分化为成熟血管内皮细胞,可作为出生后新血管发生的一个来源。有研究发现,在肿瘤生长过程中有CD+133EPC细胞趋化进入肿瘤组织,并参与肿瘤血管的形成,促进肿瘤生长。Arbab等采用磁共振、共聚焦显微镜、免疫组化等技术研究显示,FePro标记的CD+34、CD+133EPC能结合至荷瘤小鼠新生血管系统,充分证实了EPC参与肿瘤血管的新生。Stoll等发现胚胎EPC在成体中仍保持促进肿瘤新血管形成的能力,他们用活体荧光视频显微镜术显示了循环EPC优先归巢到肿瘤微血管系统的“热点部位”,并迁移至间质形成多细胞簇、合并到血管网中,从而再现了EPC归巢并参与肿瘤血管发生的全过程,并通过实验证实EPC的这种优先趋向性是由E-选择素、P-选择素及P-选择素配体-1所介导。进一步研究显示,EPC参与肿瘤组织血管形成的程度远高于普通组织的血管新生,肿瘤新生血管中EPCs占35%-45%,而普通组织仅为5%-25%。Lyden等发现,剔除一个等位基因Id1和两个等位基因Id3的小鼠肿瘤生长受抑制或者不生长,而移植了野生型骨髓的小鼠能够恢复血管形成并促进肿瘤生长。徐承平等的研究发现,人脐血EPCs能够被募集并整合到肿瘤血管中促进胶质瘤生长,提示EPCs在胶质瘤血管新生化过程中可能具有重要作用,这进一步证明了循环EPC在肿瘤血管形成中的重要作用。多数学者认为,部分肿瘤血管内皮细胞来源于骨髓源性内皮祖细胞(Bonemarrow-derivedendothelialprogenitorcells,BM-EPCs),BM-EPCs分化产生成熟内皮细胞并整合到血管中,EPC在肿瘤原发灶或转移灶生长初期必不可少。Gao等研究发现,肿瘤能诱导BM-EPCs中转录因子Id1的表达,而抑制Id1会阻断EPC的募集、抑制肿瘤转移灶血管生成及转移灶的生长,因而认为BM-EPCs是肿瘤转移灶血管生成启动的重要调节因素。肿瘤细胞或微环境中细胞释放的细胞因子和化学因子可诱导单核细胞进入肿瘤组织,缺血缺氧区域VEGF显著升高使该区域EPC也明显增多。EPCs一旦进入肿瘤组织,又将被诱导表达促血管形成因子和肿瘤促进因子,如VEGF、PDGF、FGF、TNF、MMP等,从而进一步促进肿瘤生长。然而,也有学者对此并不认同,Purhonen等采用三维细胞造影技术显示,BM-EPCs不是肿瘤血管内皮细胞的主要来源,也不为肿瘤生长所需。总之,对于EPCs参与肿瘤血管生成的研究仍处于早期阶段,有关其特异性表面标记、富集标准及增殖活性等问题还存在争议,EPCs具体参与肿瘤血管形成的哪一阶段、在肿瘤组织如何分布及其分子调控机制等问题,尚需深入研究。4血管诱导因子有研究表明,并非所有原发或转移灶的肿瘤生长到一定程度必然诱导新血管的生成,在一些血供丰富的组织,如脑、肺等,肿瘤的生长可以很好地利用其周围原有的血管系统,癌细胞沿既存的血管生长而不启动血管生成。这种肿瘤血供方式被称作血管共选择(Vesselco-option)。血管共选择现象最初是在研究血管生成早期调节分子如血管生成素(Ang)时发现。将肿瘤移植入大鼠脑组织1-2周内,瘤组织依赖宿主血管得到良好的血供,并无新血管生成启动。4周之后肿瘤供血的血管发生急剧退化,但仍无血管生成现象。随后,内部的肿瘤细胞出现坏死,而外周却开始诱导明显的血管生成。这说明某些肿瘤或转移灶起初生长时并不诱导血管生成,而是以血管共选择方式利用宿主原有血管取得血供,直到生长到一定程度,内部血管发生退化癌细胞坏死时,才由周边存活的癌细胞诱导血管生成。据推测,起初被肿瘤共选择的血管发生退化可能是宿主的一种防御反应。研究发现,共选择血管的退化是由于周细胞及平滑肌细胞的脱粘附而引起内皮细胞的退化。早期依赖血管共选择而晚期出现坏死的肿瘤中心区在肿瘤移植后2周检测到Ang-2高水平表达,而VEGF早期表达很低,后期升高,整个过程Ang-1水平无明显变化。因此,Ang-2可能调控介导了这一过程,在缺乏VEGF的情况下,Ang-2促使血管退化,而Ang-2、VEGF共表达时诱导血管生成,这两种因子的调控关系在血管生成过程中也存在。目前已经在多种肿瘤中观察到了血管共选择现象,如鼠Lewis肺癌、鼠卵巢癌、人黑色素瘤及人Kaposi肉瘤等。Kunkel等研究显示,应用VEGFR-2单抗进行抗血管生成治疗,在抑制肿瘤血管生成的同时却促进了血管共选择。这就为肿瘤血管生成抑制治疗提出了新的问题。5肿瘤vm的基因特征1999年Maniotis等在研究黑色素瘤微循环时,发现了一种与经典的肿瘤血管生成途径完全不同、不依赖内皮细胞的全新肿瘤微循环血供模式,其血液通道内没有内皮细胞的参与,全部由肿瘤细胞衬覆在基底膜样物质的表面,即恶性黑色素瘤细胞通过自身变形和与细胞外基质相互作用,模拟血管壁结构、形成可输送血液的管道系统、重塑肿瘤的微循环,并可与宿主血管连通使肿瘤获得血供。这种肿瘤血液供应方式被称为血管生成拟态(Vasculogenicmimicry,VM)。据文献报道,除了恶性黑色素瘤,在多种肿瘤中发现了VM的存在,如乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、间皮肉瘤、骨肉瘤等。研究发现,肿瘤VM只存在于一些高侵袭性肿瘤中,在肿瘤细胞构建的管道内由一层厚薄不一的PAS阳性物质将瘤细胞与血流分开,血管图案呈环状或网络样。无VM的肿瘤动物模型多可见到中央缺血坏死,形成VM的瘤体常可达直径10mm而无中央坏死灶,且恶性程度高,生长迅速,转移率高,易发生血道转移,这可能与血管无内皮细胞衬覆有关。目前认为,缺氧环境使恶性细胞基因型发生了改变,成为胚胎样的多能干细胞,能向多个方向分化,选择性表达血管内皮细胞标志物,塑形性明显提高,使其能够作为血管内皮细胞样细胞参与血管生成拟态。如同胚胎期的多向分化潜能的间质干细胞,肿瘤细胞形成血管内皮细胞样表型,分化成血管内皮样细胞,形成原始、规律的血管样网络结构。但关于其形成的具体分子机制尚未阐明,初步研究提示,基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-2、MMP-9、MMP-14)、TIMP-2、层黏连蛋白(5γ2链水解产物γ2’链γ2x链)及磷酸肌醇三激酶(PI3K)调节通路等可能发挥重要作用,MMPs可通过某种途径激活后分解切割层黏连蛋白成多个短链,最终促进血管生成拟态的发生。肿瘤VM微循环理论的建立时间较短,一些现象和机制尚待进一步循证研究,如VM血管样通道和经典血管间的沟通方式、肿瘤细胞向血管内皮样细胞逆转及其细胞表型改变的机制、VM与胚胎血管发生的关系等等。VM的发现改变了人们以往对肿瘤血供的传统观念,使人们对肿瘤细胞的一些生物学性状有了新的认识,亦为肿瘤的治疗和预后判断提供了一种极具潜在应用价值的新思路、新方法。6vegf-c和vegf-d的变化淋巴管也是循环系统的一部分,主要功能是回收组织液中的蛋白质、运输营养物质、调节体内液体平衡。长期以来,由于缺乏淋巴管特异性标志分子,人们对淋巴管生成、发展及其在肿瘤中作用的研究相对较少。随着淋巴管内皮细胞体外培养的成功及其特异性标志分子的鉴定,如VEGFR-3、LYVE-1(Lymphaticvascularendothelialhyaluronanreceptor-1)、Podoplanin及转录因子Prox1等,淋巴管生成已经成为目前研究的热点之一。肿瘤淋巴管生成(Lymphangiogenesis)是指在肿瘤原位形成新的毛细淋巴管的过程,越来越多的资料显示,淋巴管生成在肿瘤发展及转移中发挥重要作用。与血管相比,新生的毛细淋巴管仅由单层淋巴内皮细胞组成,基底膜不完整,管壁薄,肿瘤细胞易于进入淋巴管道形成淋巴结转移和远处转移。淋巴管生成的启动同样受细胞因子的调控,VEGF-C和VEGF-D是诱导肿瘤淋巴管生成最重要的因子。研究发现,转染VEGF-C的肿瘤有明显的瘤内及周围淋巴管生成,可见开放的淋巴管,其内常有肿瘤细胞,瘤周淋巴管则明显增粗,淋巴管的数量和淋巴转移密切相关。Papontai等研究表明,高表达VEGF-C的肿瘤能诱导淋巴管向肿瘤内部呈现放射状生长。与VEGF-C的作用类似,VEG