六味地黄丸血清药物化学研究

六味地黄丸血清药物化学研究

基于传统的药物化学方法，总结和应用了中国药物化学的各种现代技术，对中药治疗后的血清中移行成分进行了分析，并确定了药物效应的相关性。确定中医特定功能的应用学科。应用本方法已经成功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究,首次阐明了该复方的作用机理;进行了地黄血清药物化学的初步研究。本实验进行了六味地黄丸的血清药物化学研究。六味地黄丸出自宋朝钱乙《小儿药证直诀》,是“滋阴补肾”之首方,现临床上广泛用于多种疾病的治疗。目前,对六味地黄丸的成分及药效研究较多,但有关的成分研究大多只限于成分的定性、定量的分析,针对药效物质基础的研究很少;有关药效的研究也多只集中在免疫调节作用方面。六味地黄丸在体内以何种成分、何种形式发挥作用以及作用机理如何,至今少有明确的研究报道。因此,有必要对六味地黄丸的血中移行成分进行详细的分析,阐明其血中移行成分、代谢产物及方剂的配伍意义,从而有的放矢地改善其生产工艺,提高制备水平,提高临床疗效。1实验材料1.1umproeWaters高效液相色谱仪(Waters600Controller,Waters600Pump,Waters996PhotodiodeArrayDetector);WaterSymmetryShieldC18色谱柱(3.9mm×150mm,5μm);Nova-PakC18Guard-Pak保护柱;80-2型离心机;H66MC型超声震荡仪;sk-1型快速混匀器。1.2素lognin对照品丹皮酚(Paeonol)对照品(中国生物制品药品检定所提供);马钱素(Loganin)对照品(南京中医药大学提供);熟地黄、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻(均购于哈尔滨市人民药店,经鉴定为正品);乙腈,色谱级(美国迪马(Dikma)试剂公司);其余试剂为分析纯。1.3动物健康Wistar大鼠,体重为200±20g,6周龄,雌雄不限,黑龙江中医药大学实验动物中心提供。2实验方法2.1对照品溶液的制备按药典六味地黄丸处方称取药材,采用2000年版药典方法分别制成六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸,各称取1g,用10ml甲醇超声提取15min(2次),滤过,合并滤液,滤液干燥后加入甲醇定容为10ml,溶液过0.45μm微孔滤膜即得;另精密称取丹皮酚及马钱素对照品1mg,分别置于10ml容量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度摇匀得丹皮酚及马钱素对照品溶液;上述各样品液供HPLC分析使用。2.2相同浓度的0.2法律-pcr的相互混悬液对大鼠肝门静脉内部的吸附量的影响取Wistar大鼠,禁食12h(自由饮水),按照1.5ml/100g体重,分别灌胃给予蒸馏水、六味地黄丸、缺味六味地黄丸及单味丸的甲醇提取物的混悬液,给药60min后用1%戊巴妥钠麻醉,经肝门静脉取血5ml,血液在3000r/min条件下离心10min,取上清液1ml,加入0.2ml70%高氯酸,快速摇匀,3000r/min条件下离心10min,取上清液过0.45μm微孔滤膜,备HPLC分析。2.3酶pak-pak保护柱WaterSymmetryShieldRP18色谱柱(3.9mm×150mm,5μm);Nova-PakC18Guard-Pak保护柱;柱温30℃;流速为1ml/min;检测波长200～400nm扫描;流动相乙腈-0.15%磷酸梯度洗脱:0/100−→−−−−0∼60min12/88−→−−−−−60∼130min30/700/100→0∼60min12/88→60∼130min30/70。2.4建立hplc分析取10批六味地黄丸供试品溶液,以及5批六味地黄丸血清样品在相同的色谱条件下进行HPLC分析,建立HPLC色谱图,并比较分析确定进入血液的成分。并通过缺味六味地黄丸及单味丸及其血清样品的分析测定,对相应的色谱图进行比较分析,确定入血成分的来源药物。3复方配伍山基层党组织所含成分的检测结果3.1六味地黄丸给药后血中出现了11个移行成分(图1),与体外样品比较,其中七个为体外成分直接吸收入血,即1、2、4、5、7、10、11号峰为六味地黄丸中所含的原型成分,且1号峰转运入血后的相对含量有较大的提高,而11号峰却明显下降;3、6、8及9号峰为新产生的代谢产物。经与六味地黄丸、空白血清及单味生药比较分析确定入血成分的来源为:1号峰的归属较为复杂,来源于三种生药。首先,熟地中含有此成分,此成分在六味地黄丸和熟地中含量均很低,但是吸收入血后此成分的相对含量大大提高,表明复方配伍后其有较强的血中转移能力(图2);其次,在除去熟地的样品给药后,血清中仍然出现1号峰,表明其他药材在体内对1号峰的产生也有贡献;山茱萸和泽泻中虽不含有此成分,但给药后血中也能产生该峰(图略),经光谱分析表明与六味地黄丸血清中的1号峰为同一成分,所以推测山茱萸和泽泻中所含的物质被代谢后共同产生该成分。可见,复方中三种生药对血中同一成分1号峰有共同贡献,表明熟地配伍山茱萸和泽泻的必要性及复方配伍的科学性。2、4、5、10号峰为山茱萸所含成分直接入血而形成,经与标准物质对照表明5号峰为来源于山茱萸的马钱素;7和11号峰为牡丹皮中所含成分直接入血而形成(图3),经与标准物质对照表明11号峰为来源于牡丹皮中的丹皮酚;3、6、8、9号峰为丹皮酚的代谢产物(图4,图5)。所以,血清样品中丹皮酚峰较体外样品中明显下降。丹皮酚被吸收入血后,其代谢产物量较大,具有产生药效的可能性,或许具有更强的生理活性。从3、6、8、9号峰的保留时间和UV光谱推测可能为丹皮酚的脱甲氧基代谢物、葡萄糖醛酸或胆汁酸的结合体。3.2本研究初步阐明了六味地黄丸的体内部分化学成分,其结果已能在某种程度上阐明该方配伍机制及药效物质基础。本文仅报道血清中有紫外吸收成分的情况,血中成分的分离及鉴定、研究结果将另报。综合研究结果将对六味地黄