h1n1亚型猪流感病毒ha基因克隆及致病特性研究

h1n1亚型猪流感病毒ha基因克隆及致病特性研究

猪流畅性（si）是目前影响养猪业的重要肠道疾病之一。这是单个猪场中常见的一起疾病之一。不仅如此,猪流感病毒(swineinfluenzavirus,SIV)与人流感的流行有着密切的关系。2009年暴发的甲型H1N1流感大流行蔓延至全球200余个国家和地区,确诊的死亡病例近2万人(刘志辉等,2012);因此,SI具有重要的公共卫生意义,而对于H1N1亚型SI的研究,重新引起了人们的严重关注(Shinde等,2009;朱来华等,2010)。动物模型是研究流感病毒致病机制的重要基础。目前流感病毒的动物模型主要包括小鼠、雪貂、猪、灵长类动物等(Barnard,2009)。小鼠是应用最多的试验动物模型,常被用来进行细菌及病毒的致病性和免疫效果评价。目前,研究人员已利用BALB/c小鼠进行了H5N1亚型流感病毒的感染、免疫和抗病毒药物等方面的研究,结果表明BALB/c小鼠对流感病毒易感,适合作为动物模型(Xu等,2006,2009)。细胞因子(cytokine,CK)在机体免疫应答过程中起着十分重要的作用,在某些疾病时,机体内细胞因子基因表达可能异常,进而导致疾病的发生及病情加重。此外,许多致炎细胞因子及趋化因子的变化与疾病密切相关。研究结果表明,细胞因子在呼吸道合胞病毒(RSV)等病毒性肺炎发病中发挥重要作用(Jafri等,2004),IL-6可通过可溶性IL-6受体(sIL-6R)调节间质性肺炎的全身及局部炎性反应。IL-1β在人类免疫缺陷病毒相关肺炎中介导肺脏组织损伤。肺炎时支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-8与肺炎严重程度有关,参与多形核白细胞(PMN)介导的肺炎致病过程,且急性期肿瘤坏死因子-α(TNF-α)明显升高。但关于H1N1亚型SIV感染哺乳动物致病机理的相关报道较少,故本研究对H1N1亚型SIV的血凝素(HA)基因进行克隆、遗传进化分析及其对小鼠致病性的研究,初步了解该病毒HA基因的分子进化特征及其对哺乳动物的致病性,为进一步开展H1N1亚型SIV对哺乳动物致病机理的研究奠定基础。1材料和方法1.1病毒分离和鉴定A/swine/Guangdong/2/2012(H1N1)病毒由佛山科学技术学院预防兽医重点实验室分离、鉴定并保存;6周龄雌性的SPF级BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。1.2主要试剂RNA提取试剂盒购自LifeTechnology公司;SYBRPremixExTaqTM购自宝生物工程(大连)有限公司;UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。1.3引用设计1.4反应条件及测序参照TRIzolLSReagent的说明书提取病毒RNA。按常规RT-PCR方法扩增HA基因,反应条件:42℃反转录60min;94℃预变性5min;94℃变性40s,53℃退火40s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min。PCR产物克隆到pMD18-T载体中并送上海博亚生物技术有限公司测序。应用Mega5.1Beta4软件进化序列分析并绘制进化树。1.5小鼠滴鼻途径接种量选取血凝效价为1∶256的H1N1亚型SIV含毒鸡胚尿囊液以滴鼻途径分别接种9只BALB/c小鼠,0.1mL/只,并设生理盐水对照。攻毒后观察其临床症状及死亡情况,分别在攻毒后第1、3和7天各取3只试验组和对照组小鼠,处死后无菌解剖。1.5.1大鼠器官系数的测定无菌解剖取小鼠肺脏、脾脏和脑组织,并计算肺脏指数、脾脏指数和脑指数。公式为:1.5.2肺组织病理学的观察于感染后第3天处死试验组和对照组小鼠,取肺脏组织固定于4%甲醛中,石蜡包埋,常规病理组织切片处理,HE染色观察组织病理变化。1.5.3实时荧光定量pcr检测应用总RNA提取试剂盒抽提脑、肺脏和脾脏组织总RNA,采用M-MLV反转录酶和随机引物反转录获得cDNA。以cDNA为模板,分别采用特异性引物,据优化的反应条件进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR扩增条件:95℃预变性30s;95℃变性5s,61℃退火37s,40个循环。记录Tm值和熔解曲线。1.6统计分析2结果与分析2.1ha基因的进化分析所扩增的HA基因片段为1701bp,编码567个氨基酸,裂解位点序列为IPSIQSR↓GL,符合低致病性流感毒株的分子特征。HA基因与GenBank中登录的A/swine/Guangdong/09/08HA基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性最高,均为99%。与A/swine/HongKong/1733/2002(H1N1)的核苷酸和氨基酸序列的同源性最低,均为95%。系统发育进化树结果显示,HA基因的进化分为人源、猪源和禽源3个谱系;该分离株HA基因与A/swine/Guangdong/2/01位于同一分支,亲缘关系较近,位于猪源的分支谱系(图1)。2.2小鼠感染前感染情况接种病毒后,小鼠表现出不愿运动,嗜睡,体温降低,食欲欠佳,部分皮毛松乱等症状;但无咳嗽和死亡,体重较感染前下降,对照组的小鼠无异常表现。与对照组相比,试验组肺脏指数、脾脏指数和脑指数均稍微升高,但差异均不显著(P>0.05)(表2)。2.3炎性细胞浸养由图2可知,试验组小鼠的肺间隔较正常肺脏组织明显增厚,可见炎性细胞浸润,以淋巴细胞为主。肺泡腔内见少量异常分泌物,肺泡间隔中的毛细血管明显扩张充血,周围肺泡腔呈代偿性肺气肿。2.4小鼠感染前后il-1、tnf-和tnf-变化情况由图3可知,试验组小鼠脑组织中IL-1β、IL-10、IRF-3和TNF-α4种细胞因子mRNA表达水平与对照组相比均有不同程度的上调,特别是IL-1β在小鼠攻毒后第3和7天均极显著上调(P<0.01),IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均显著上调(P<0.05),但IRF-3和TNF-α在感染后与对照组相比差异均不显著(P>0.05);IP-10mRNA的转录水平在感染后第1天即显著上调并达到高峰(P<0.05),此后下降到低于对照组的转录水平,但差异不显著(P>0.05);而IFN-α和IFN-β在感染后均低于对照组,但差异均不显著(P>0.05)。2.5小鼠感染前后ifn-、局部下降的情况由图4可知,小鼠肺脏组织中IL-1β、IL-10、IFN-β、TNF-α和IP-105种细胞因子mRNA表达水平在感染第1天后均低于对照组,但差异均不显著(P>0.05),第3天均极显著上调(P<0.01),此后下降到低于对照组小鼠的转录水平,但差异均不显著(P>0.05);IFN-α在感染后第1和7天均低于对照组,而第3天上调,但与对照组相比差异均不显著(P>0.05);IRF-3mRNA表达水平在感染后第3天显著上调(P<0.05),而第1和7天与对照组相比均下调,但差异均不显著(P>0.05)。2.6小鼠感染降低il-1和tnf-的细胞因子检测由图5可知,小鼠脾脏组织中IFN-α、IFN-β、IL-1β、TNF-α、IP-10、IRF-3和IL-107种细胞因子mRNA表达水平与对照组小鼠相比均有不同程度的上调,特别是IFN-α在小鼠攻毒后第3天极显著上调(P<0.01);IL-1β和IRF-3在小鼠攻毒后第3和7天均显著上调(P<0.05);IL-10、IFN-β和TNF-α3种细胞因子在感染后第3天均显著上调(P<0.05),但第1和7天与对照组相比均下调,差异均不显著(P>0.05);IP-10的转录水平在感染后第3天上调,但差异不显著(P>0.05),而在第7天显著上调(P<0.05)。3ha基因裂解位点序列及同源性比对及进化关系季节型流感病毒不能直接感染老鼠,但毒株在小鼠中经肺脏传肺脏的传代过程后毒力和致病性增强,从而成为鼠肺脏适应株甚至致死株,而一些高致病性的H5和H7亚型禽流感病毒可不经过适应而直接对小鼠致病,因此常被作为流感病毒致病性研究的哺乳动物模型(Ward,1997;Herfst等,2010)。Herfst等(2010)利用该病毒感染食蟹猴,结果发现新型甲型H1N1病毒也引起以弥漫性肺泡损伤为主的肺脏部病理变化。在本试验中,使用H1N1亚型SIV尿囊液原液感染BALB/c小鼠,结果表明该病毒所引发的症状不明显,致病力较弱,且对BALB/c小鼠并不致死,与王连想等(2003)报道的H1N1亚型SIV分离株接种小鼠后未导致小鼠出现症状和死亡的结果相同。HA蛋白是流感病毒的膜外蛋白,可与靶细胞表面的唾液酸结合,帮助病毒颗粒黏附于细胞表面,使病毒得以侵入细胞。血凝素蛋白与病毒易感的宿主范围和宿主对病毒感染产生的免疫反应有直接联系,其裂解性、受体特异性和糖基化是决定流感病毒感染性和致病性的重要因素(Hoffmann等,2001)。Matrosovich等(2008)研究结果发现,HA1和HA2裂解位点处多1个碱性氨基酸的插入和糖基化位点的缺失均能使HA对蛋白酶切割的敏感性增强,从而使致病力提高。本研究毒株HA基因裂解位点序列为IPSIQSR↓GL,符合低致病性流感毒株的分子特征;且在小鼠的攻毒试验中,小鼠只有轻微的症状,并不能致死,分子特征和动物试验结果表明该H1N1毒株属于低致病性毒株。同源性比对及进化关系结果表明,本研究分离的毒株与猪源SIV进化关系很近且同源性较高(最高为99%),与禽源H1N1进化关系较远,本研究毒株仍为猪源SIV。细胞因子是主要由活化的免疫细胞或间质细胞所合成、分泌的小分子多肽,具有调节免疫应答、参与炎症反应、促进创伤愈合等功能,作为一类重要的生物应答调节剂,在一些疾病发生、发展过程中起着重要作用,细胞因子的检测越来越受重视。在免疫学领域,许多研究结果表明病毒性疾病感染与组织细胞中致炎细胞因子及趋化因子的变化密切相关。流感病毒,尤其是H5N1毒株,在体外可诱导多种细胞释放高浓度的促炎症细胞因子,在体内的局部器官和血浆中也存在着大量促炎症细胞因子的积累,大量释放和积累的促炎症因子,如TNF-α和IL-1β等,通过细胞因子的级联反应(cytokinecascade),产生以细胞因子分泌失调和过度释放为表现的细胞因子风暴效应(cytokinestorm),从而可能引发相应的免疫病理损伤,这种以促炎症细胞因子过度释放导致的细胞因子风暴被认为是高致病性H5N1引起严重疾病的可能原因(Shu等,2009;Bailey等,2007;Vaknin-Dembinsky等2006)。IL-1β和TNF-α是重要的促炎症因子,能导致其他炎症细胞因子、趋化因子和黏附分子等的合成,其表达发生强烈上调时,则引发细胞因子风暴。本研究应用建立的细胞因子mRNA实时荧光定量PCR检测方法,对H1N1亚型SIV感染的BALB/c小鼠肺脏、脾脏和脑组织中7种细胞因子mRNA表达进行定量检测,结果显示,H1N1亚型SIV感染的小鼠肺脏、脾脏组织样本中IFN-α、IFN-β、IP-10、IL-1β、TNF-α、IRF-3和IL-10mRNA含量在感染第3天普遍升高;而脑组织样本中IL-1β和IL-10在小鼠攻毒后第3和7天均显著上调(P<0.05),表明小鼠感染H1N1亚型SIV第3天肺脏、脾脏和脑均有炎症发生,这与3个脏器系数有轻微升高相符合,特别是肺脏促炎症因子TNF-α在第3天有显著的上调(P<0.05)。细胞因子虽有抗病毒的作用,但也会造成组织损伤,IL-10是一种多效的抑制性细胞因子,不仅能抑制T细胞、单核细胞和巨噬细胞等的活化及各类细胞因子的产生,也能促进B细胞和天然杀伤性细胞的分化和增殖,促进单核细胞和巨噬细胞募集及肥大细胞集落。另外,IL-10还能与转化生长因子(TGF)协同调