第4章 基因组测序与序列组装3+1陈竺

第四章基因组测序与序列组装1、DNA测序的方法链终止法测序化学降解法测序自动化测序非常规DNA测序1.1链终止法测序(thechainterminationmethod)

基本原理:

通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。（一）DNA的酶法测序（双脱氧终止法）1955确定牛胰岛素结构，1958获诺贝尔化学奖1975设计出DNA测序法，1980获诺贝尔化学奖Sanger合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群1971年，吴瑞将引物延伸（primerextension）用于DNA测序。吴瑞发明的联接子（linker）和衔接子（adaptor）迄今仍然是克隆DNA的常用工具他主编的《重组DNA》曾风靡分子生物学和生物技术界。上世纪80年代后，吴瑞在水稻转基因技术上有先导性贡献。吴瑞（1928-2008）吴瑞在分子生物学和植物生物学等领域有重要贡献。技术路线与要求制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸

↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列A克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性B无5’→3´外切酶活性C无3´→5´外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子连接的是氢原子,不是羟基对DNA聚合酶的要求A高酶活性：

聚合酶在终止合成前，多聚核苷酸分子可延伸的有效长度B无5’→3´外切酶活性外切核酸酶活性C无3´→5´外切酶活性较读功能Klenow酶250bp测序酶sequenase

3’5’5’3’外切酶聚合酶NC5’3’外切酶小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）聚合功能蛋白水解酶水解有限产物,68000和35000的片段，用途：双链DNA5'突出(5'overhang)末端的补平(fill-in)；双链DNA3'突出(3'overhang)的打平(也称削平)；5'突出末端的标记；随机引物法进行DNA标记；Sanger双脱氧法进行DNA测序；cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。3'→5'外切酶活性──校对作用这种酶活性的主要功能是从3'→5'方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。5'→3'外切酶活性──切除修复作用从5’→3’方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5’-脱氧核苷酸。A克隆于质粒中DNA对模板的要求小于3kb的可以进行，是包装在噬菌体中的单链DNA，容易丢失和重排。用碱或热变性，可能有未纯化的DNA沾染，干扰测序反应，但是最常用方法。BM13克隆单链DNAC噬粒克隆DNA10kb，质粒自身的复制起点，还有一个M13或者其他的单链DNA噬菌体的复制起点，大肠杆菌中含有噬粒和辅助噬菌体时，因携带噬菌体复制酶和外壳蛋白的基因，所以激活噬菌体DNA复制，产生单链噬粒噬菌体，比M13稳定。用标记了金属粒子的引物，磁性装置纯化后使用。对模板的要求DPCR产生单链DNA对引物的要求1.2化学降解法测序基本原理:

在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解.技术路线将双链DNA样品变为单链↓每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带↓分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体↓电泳,读取DNA的核苷酸顺序Maxam-Gilbert法所用的化学技术

碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对N7进行甲基化,使C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子位置脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5mol/LNaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例哌啶硫酸二甲酯1.3自动化测序基本原理与链终止法测序原理相同,只是用不同的荧光色彩标记ddNTP,ddATP标记红色荧光ddCTP标记蓝色荧光ddGTP标记黄色荧光ddTTP标记绿色荧光.由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基.DNA序列分析仪：四色荧光基团标记的dNTP120台毛细管电泳装置24小时连续作业，一天工作量是1亿个碱基长度的DNA，4天就可测完水稻基因组光点测序脱氧三磷酸核苷酸连接到DNA3’-末端时会释放1个焦磷酸(PPi),焦磷酸在磷酸化酶的作用下转化为化学能,并发出光亮.1.4非常规测序DNA芯片测序将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上,每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置.待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装,拼接成完全的DNA顺序.利用基因芯片进行杂交测序的原理可测DNA片段的长度是芯片上排列的寡聚核苷酸数目的平方根。2、基因组测序2.1基因组测序的策略作图测序（克隆依次测序）按照大分子DNA克隆绘制的物理图分别在单个大分子DNA克隆内部进行测序和序列组装，然后将彼此相连的大分子克隆按排列次序搭建支架，最后以分子标记为向导将搭建好的支架逐个锚定到基因组整合图上。2、基因组测序2.1基因组测序的策略鸟枪法测序（全基因组随机测序）将整个基因组DNA打断成小片段后将其克隆到质粒载体中，然后随机挑选克隆对插入片段进行测序，以获得的测序序列构建重叠群。在此基础上进一步搭建序列支架，最后以分子标记为向导将序列支架锚定在基因组整合图上。基因组测序覆盖面：随机测序获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆盖面越大，遗漏的序列越少。2.2基因组测序的覆盖面基因组测序覆盖率达到99.99%，覆盖面要达到8次以上。序列间隙：测序时遗漏的序列。2.3序列间隙和物理间隙2.3序列间隙和物理间隙物理间隙：构建基因组文库时丢失的DNA序列。1、碱基组成特殊，着丝粒附近，高度重复，缺少酶切位点，难已获得大分子克隆2、高度重复序列不稳定，在扩增中容易丢失3、某些基因的表达产物对宿主菌有毒性序列间隙：先设计探针，找到阳性克隆，然后设计引物，PCR，重建克隆体，测序物理间隙：原因：1、碱基组成特殊，着丝粒附近，高度重复，缺少酶切位点，难已获得大分子克隆2、高度重复序列不稳定，在扩增中容易丢失3、某些基因的表达产物对宿主菌有毒性，2.4插入片段的两端测序3序列的组装3.1随机测序与序列组装

随机测序也称”鸟枪法”.序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸.优点:不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序计算机拼装ABC小片段测序计算机拼装鸟枪法(Shotgun)测序的问题CAATGCATTA……GCAGCCAATGCGAP错装实例:流感嗜血杆菌基因组的测序及顺序组装

Ceralagenomics公司1995超声波打断纯化的基因组DNA↓琼脂糖电泳收集1.6∼2.0Kb的区段、纯化

↓构建到质粒载体中↓随机挑选19687个克隆,进行28643次测序,得到可读顺序为11631485bp↓组装成140个覆盖全基因组范围的独立的顺序重叠群,↓各重叠群间仍有间隙(139个)

序列间隙（99个）物理间隙（23个）

↓↓

载体或宿主菌选用不当而被丢失的顺序测序时遗漏的测序解决办法:通过相邻已知顺序作为探针筛选已有的基因组文库解决办法:利用其它宿主菌与载体重新构建文库解决办法:利用其它宿主菌与载体