化学工程与工艺-柠檬香蜂草中多糖的提取工艺研究

绪论第一章绪论1.1柠檬香蜂草及国内外研究现状1.1.1香蜂草简介柠檬香蜂草又被称为“柠檬香薄荷”、“香蜂花”。属于唇形科，是多年生草本植物，其原产地为欧洲地中海两岸，主要生产地为法国，在中国的中南、西南和台湾也有其野生分布，但是目前种植较少[1]。柠檬香蜂草具有清新的柠檬香气,既可作为食物,又可入药。作蔬菜食用,能提供人体所必须的养分。香蜂草的新鲜叶子和嫩梢中,含有丰富的蛋白质、维生素等多种营养物质。其中又含有大量硒,对人体健康有很大好处。且香蜂草生长周期短、病虫害较少,不需要农药,故可做到真正的绿色保健[2]。在食用方面,可作凉拌直接生吃,也可作为其他菜品的调味料。在医疗方面,可将香蜂草与蜂蜜混合食用，可以起到促进消化、减缓喉咙痛等症状。可将新鲜的叶子直接敷于创口处或蚊虫叮咬处,有止血止痛的功效,可谓“绿色伤药”。除此之外，柠檬香蜂草还属于传统民间医药，对于失眠、偏头痛、焦虑症、精神病、胃痛以及支气管疾病、高血压有一定的辅助治疗的作用。关于综合利用加工方面，芳香精油还可从柠檬香蜂草中提炼，可用于加工香枕、香袋、保健香茶等。1.1.2柠檬香蜂草的化学成分研究进展对柠檬香蜂草中的化学成分进行分析，发现每100g香蜂草的新鲜嫩芽中，含有还原糖2.66g、粗蛋白5.75g、纤维素5.93g、VC1.2mg、胡萝卜素0.24mg、钾804mg、钙309mg、镁149mg、铁5.38mg、锌0.97mg、锶1.5mg、锰0.75mg、硒3.26μg，还包括芳香油、苦味素、黄酮等有机化合物。而钾、钙含量较明显较高[3]。除上述物质外，香蜂草内还蕴含极其丰富的有机物，包括醛类化合物，例如柠檬醛、香茅醛、橙花醛、香叶醛等；萜类化合物，例如香茅醇、香叶醇、乙酸芳樟酯、芳樟醇、单宁酸、α-蒎烯、β-蒎烯、β-石竹烯等；酚类化合物，例如迷迭香酸，咖啡酸和3，4-二羟基苯基乳酸酯；和一些天然的黄酮类化合物，例如木犀草素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖醛苷、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等[4]。冀紫阳[5]等人对通过研究柠檬香蜂草的药用化学成分，将柠檬香蜂草提取液的浸膏部分经过硅胶柱层析、重结晶、制备薄层色谱等方法分离纯化，从中得到了13个化合物，它们分别为：原儿茶醛（1）、三对节酸（2）、香草醛（3）、2α，3β-二羟基乌苏-12烯-28-酸（4）、乌索酸（5）、齐墩果酸（6）、胡萝卜苷（7）、2α，3β，23,29-四羟基齐墩果-12烯-28-酸-29O-β-D-吡喃葡萄糖苷（8）、木犀草素（9）、迷迭香酸（10）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（11）、β-谷淄醇（12）、十六烷酸（13），结构式如下：柠檬香蜂草成分繁多，营养丰富，也正是由于这样的特性，人们的它的研究热情也愈加浓厚。1.1.3柠檬香蜂草的药理研究进展目前有关柠檬香蜂草的记录可以追溯到4000多年前,分为亚洲、欧洲两大香蜂草门类。中国古代医术上,也有关于香蜂草的记载,它的药理作用有祛风发汗、退热止痛等。近些年来,国外也对香蜂草的药理作用极其重视,由于香蜂草药性温和,通常将其作为镇静剂、抗菌剂等，并被手录入《欧洲药典》。 在镇静舒缓方面,柠檬香蜂草有明显的药用价值，对于焦虑症、抑郁症等常见病症，都有不俗的治疗兼预防效果。有实验表明,柠檬香蜂草提取物对小鼠具有抗焦虑的作用。γ-氨基丁酸(GABA)作为一种神经递质,可以在中枢神经系统中介导抑制性突触传递,人们从它入手,进而深化研究诸如焦虑症的病理、机制和相关药物等。而有试验显示,柠檬香脂提取物可以抑制γ-氨基丁酸转氨酶。这也说明了香蜂草在抵抗焦虑方面的重要作用[6]。 在认知改善方面,柠檬香蜂草中的提取物具备乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制活性,其抑制剂能够通过降低突触间隙的胆碱酯酶活性,使乙酰胆碱分解从而失去原有的高水平,并且进一步增加乙酰胆碱的活性,从而实现神经保护。由于柠檬香蜂草提取物有可以清除自由基的性质,并且对单胺氧化酶(MAO)有抑制作用,所以还对亚甲二氧基甲基安非他明(MDMA)诱导的海马初级神经元细胞的死亡有一定的维护作用。故而能够作为神经保护药物,来避免中枢神经系统出现问题。这也显示了香蜂草提取物在防止神经退行性神经疾病方面的用途[7]。 在抗菌方面,柠檬香蜂草的乙醇分馏物具有十分明显的抗菌作用,其与亚硝酸钠等具有相同的抗菌作用。提取物中还有诸如咖啡酸、、黄酮类、迷迭香酸等其他物质,也具备抗菌活性。 经多方面研究证实，柠檬香蜂草在抗病毒方面具备抗病毒的能力,尤其在对抗一型和二型单纯胞疹病毒中有显著效果。通过运用病毒结合试验,马赞蒂证明了柠檬香其余蜂草提取物并没有阻挡二型病毒进入宿主细胞,由此可以推断该机制的作用可能是在病毒进入之后才能发挥出来。 柠檬香蜂草还可用于抗肿瘤方面，能够对结肠癌起到辅助治疗的作用,其挥发油对抵抗一系列人肿瘤细胞株(A549,MCF-7,Caco-2,HL-60,K562)和小鼠癌细胞株(B16F10)非常有效。还可清除DPPH自由基, 其极高的抗氧化活性可应用于提高血糖耐受水平方面[8],柠檬香蜂草精油对于调节2型糖尿病小鼠的血糖和血脂具有重要作用,可以增强2型糖尿病病人的血糖耐受性,同时促使血清中胰岛素水平显著上升。糖尿病及其并发症由于氧化应激和活性氧导致,因而2型糖尿病病人人体内含有的自由基的会增加,致使抗氧化酶活性失去原有的高水平。脂质过氧化物水平会增高,所以适当摄入如柠檬香蜂草精油的抗氧化营养物质,可能有益于减轻或防止糖尿病症状或并发症。 抗脂肪组织的形成方面来说,脂肪组织形成经过需要脂肪细胞分化、血管生成和细胞外基质重塑,血管生成往往领先于脂肪细胞分化。柠檬香蜂草的分馏提取物可降低脂肪组织中血管生成因子(VEGFs和FGF-2)和基质金属蛋白酶(MMP-2和MMP-9)的mRNA水平,而增加血管生成抑制剂(TSP-1和TIMPs)的mRNA水平,具有抑制基质金属蛋白酶(MMP)的活性、抗血管生成的作用,同时还可以抑制前脂肪细胞分化为脂肪细胞,起到显著降低基因型肥胖小鼠脂肪组织的增加的作用,这表明作为血管生成抑制剂的香蜂花可防止肥胖发生[9]。 总之,柠檬香蜂草可应用在诸多领域，如食品、化妆品、日用品等领域。其良好的抗氧化活性也将有利于在食品贮藏、保鲜等方面的潜力开发。现今社会食品安全卫生问题日益严峻,人们也愈加重视这一问题。天然的柠檬香蜂草与这一安全发展趋势相符。所以进一步开展对柠檬香蜂草的研究,如何让食品行业更好地利用一天然植物资源，已具备重大意义。1.2多糖的提取技术研究进展1.2.1多糖简介多糖,也叫多聚糖,它是一种自然形成的、由多个单糖或单糖衍生物聚合构成的大分子化合物,普遍存在于动植物和微生物(细菌和真菌)中。因为多糖结构的复杂性,人们对它的认知还停留在为生物提供能量,或作为生物本身的构造材料。而这样的认知也停留了相当的一段时间。1943年,人们开始将多糖作为药物使用。上世纪70年代,人们发现了多糖和它的复合物能够参与到生物体的生命活动中,自此，多糖及其化合物以免疫调节剂的新身份,进入了人们的视线[10]。中国对多糖的各项研究,相比全世界较迟。然而多年来,随着各方面技术的不断进步,国人也意识到了研究多糖及其化合物对我们有着及其重要的意义。有研究表明,多糖和增强免疫力、识别并交换细胞物质方面都有着高度相关性,对于细胞生长和分裂分化也有重要的调节功能,甚至在癌症的治疗方面,也有着不容忽视的作用。正因为多糖有如此多的重要功能,人们也开始重视对多糖的相关研究,包括对其结构、药理、乃至其开发方面,并召开相关会议,共同商讨有关问题,致力于将多糖的运用再上一个台阶[11]。当前,以美德日三国在多糖相关研究方面为首,中国作为后发现代型国家,对这一方面认识不足,稍稍落后于上述三国。但在研究其机理时,我国科研人员结合自身情况,巧妙地将其与传统中医相结合,这也益于其他相关学科的发展,终使我国的多糖研究进展空前。通过当前的研究成果可以确定,多糖的生物活性在更大程度上,由其高级结构觉得,并且与之相关的因素和纬度十分丰富,包括结构、溶解度等。正是由于其相关纬度的丰富性,导致了多糖在其生物活性方面,有极佳的可操作性。人们可以利用其生物活性,来达到抗衰老,抗病毒,调免疫,降血糖血脂等目的[12]。1.2.2研究多糖提取的目的和意义多糖作为天然产物中的一个大类别,来源甚广,在动物、植物、微生物等体内都能够找到。鉴于多糖具有抗病毒、抗肿瘤等及其重要的作用，科研人员致力于完善多糖的提取技术，使其能够更好的利用与防治各种疾病。在有关多糖提取的众多研究中,英膜多糖提取是一个突出的成果,它是从细菌类的微生物中提取而得,科用于疫苗。而对于它的研究,相比于其他方面较早且频繁。[13]1984年,主题为碳水化合物的国际讨论会于荷兰召开,这次由前苏联学者主持召开的会议,让英膜多糖在疫苗方面的应用成果展现于世人面前,受到了业内的极大赞誉。受此次大会的影响,人们对在真菌类微生物中提取多糖的有关研究愈加深入,并且拓宽相关研究领域:如在抗肿瘤方面有突出成效的香菇多糖、以前未曾涉足的海藻类多糖等。如今,多糖类的研究愈加深化,现在能够从各类动植物和微生物中提取出的多糖,已逾300多种[14,15]。多糖作为非特异性的能够增强免疫力的药剂中的一员,不但可以赋予诸如巨噬细胞等免疫细胞活力,而且还能加速细胞因子产生,从而令机体的免疫力水平更上一个台阶。经张伟云等人研究证实,从紫菜中提取出的多糖,可以加强小鼠骨髓、脾脏淋巴等细胞的增值,令混合淋巴细胞之间的反应愈加充分,在此基础上,还能够抑制白血病细胞[16]。也有其他研究表明,从香菇中提取出的多糖,在加强小鼠产生的抗体数量、提高免疫力水平、令脾脏增重等方面也有不容忽视的作用[17]。 多糖还具有预防和抵抗癌症的作用,它可以强化一般细胞抵抗致癌物的能力,并使抗体的抗癌水平进一步升高。不但副作用少,还能够缓解由化疗引起的诸多不良反应。除此之外,多糖对于艾滋病也有治疗作用。由于多糖免疫疗法的问世,给人们带来了新的希望和研究方向,人们以此为出发点,开始向肿瘤、艾滋病以及其他类似病症进发。而由于多糖在自然界中来源之广泛,包括从微生物类和自然植物类提出的多糖,都具备抗肿瘤的能力,这也给有关研究赋予了极大的可行性。多糖通过刺激单核吞噬细胞,从而强化免疫球蛋白,使机体消炎和脱敏。另外,有些多糖能够干预对微生物病原体的吸附过程，使其难以吸附靶细胞。研究表明，中华称猴桃多糖可起到抑制大肠杆菌的作用，能够增强机体的抗菌能力。同样能增强抗菌能力的还有云芝胞内多糖，将其与抗生素结合，可用于治疗老年性慢性尿路感染，对慢性肝炎也有疗效，而在抗病毒方面有显著成效的是从海藻中提取的多糖[18]。研究证明,影响动脉硬化的一个重要因素,是低密度脂蛋白的含量。而甘油三酯和胆固醇的含量异常,也能够触发类似疾病。若低密度脂蛋白含量提升,便很容易触发心梗。而高密度脂蛋白则刚好与之相反,作为“血管清道夫”,它可以把周围组织中富余的胆固醇、低密度脂蛋白、甘油三酯等,输送到肝脏,并使之通过代谢反应将其消耗(转化成胆汁酸或直接从肠道排出)。所以,高密度蛋白对心肌梗塞有一定的治疗效果。 浒苔多糖能够令血液中胆固醇含量过高的小鼠的血清胆固醇和甘油三酷的含量水平明显降低,这也证明了浒苔多糖对于降血脂有着显著的功效[19]。将南瓜多糖由腹腔分别注入正常小鼠和糖尿病小鼠,一段时间后,两小鼠的胆固醇和低密度脂蛋白明显下降,高密度脂蛋白则升高。由此证明,南瓜多糖可以明显改善脂质代谢,以起到降低血脂的作用[20]。在降血糖方面,有研究证明,将知母多糖注入正常小鼠和四氧嗜睫致糖尿病小鼠体内后,两只小鼠的血糖都明显降低[21]。对于多糖提取的研究，国际上虽起步较晚，但由于其及其重要的作用，已经引起药理学家和化学家的极大兴趣，甚至有科学家预言：“今后数十年将是多糖时代”，可见多糖的研究将在未来成为生物学和药学中不可或缺的一部分，而研究多糖的提取也具有极其重要的意义。1.2.3主要研究方法1.2.3.1溶剂提取法溶剂提取法以其成本低廉,简单方便,并且无需特殊设备等优点,广泛的用于各类植物有效成分的提取。溶剂选择作为该方法中最为重要的一环,应按照以不同极性的溶剂提取植物中不同极性的有效成分的原则进行原则,即相似相溶原理,。水由于其自身所具备的强极性,被称为最具代表性的溶剂,在所有溶剂中具有突出地位。水能够穿过植物的细胞壁直达有效成分并将其提取,且相比其他溶剂,水更加安全稳定,故在各类化学提取中被大量使用[22]。在溶剂提取法中,影响有效成分提取率的因素,包括提取的温度、时间和溶剂用量等。应根据提取产物和提取要求,结合实际情况,选择最佳条件和最佳方案。何颖娜[23]以香菇柄为原料，运用溶剂提取法提取多糖。在70℃的条件下，以0.2mol/L稀盐酸溶液作为溶剂进行浸提。经多次试验，得多糖提取率为10％左右。溶剂提取法作虽有以上等等显著优点,但其缺点也同样明显,如在提取过程提取率往往不高,操作过程耗时等。1.2.3.2酶法提取酶法作为一项生物技术,以其显著的特点,在近一段时间来常被应用在各个领域。要从天然植物中提取出目的产物,则需先穿透包裹有效成分的植物细胞壁和细胞膜。而酶提法是利用酶对细胞结构的破坏作用,使被包括的有效成分能够还无阻碍的被溶剂所提取,而在这过程中,在无需剧烈反应的。将植物组织进行分解,以便于使有效成份能够快速的被提取,降低有效成分被提取的门槛,这边是酶法不同于其他方法的特别之处。维素酶、果胶酶等,都是在提取过程中被最常用到的酶。李小平[24]同时采用果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶四种酶，研究酶法提取红枣多糖的工艺。优化的各项参数为：加酶量0.02％，PH为4.5，提取温度60℃，提取时间为2h。经多次试验，发现纤维素酶对红枣多糖的提取率最高，为3.79％，胰蛋白酶对红枣多糖提取率最低，为1.79％。1.2.3.3超声提取超声波之所以能够用来提取有效成分,是由于其具空化效应,能够令溶剂穿透细胞壁,通过物理破碎,从而提取有效成分。当超声波振动时,能引起媒质进入振动态,使溶剂于有效成分迅速接触,并与溶剂相混合。与此同时由于超声波的作用,液体内会形成空化泡。空化泡涨大、破裂,释放声场能量,细胞壁被其能量造成的温压破坏,有效成分得以迅速与溶剂相混合并被提取出来。而在超声提取过程中,有一些附带的效应也是不容忽视的,诸如乳化扩散等。这些次级效应也能够加速植物有效成份在溶剂中的扩散释放,有利于提取。超声波提取有提取时间短、效率高等特点,在许多生产操作中得以应用[25,26]。韩荣生等人在超声条件下提取甘草中有效成分甘草多糖并测定其含量，以筛选获得适宜的甘草多糖提取工艺条件[27]。采用正交试验设计，选取提取时间、提取温度及料液比作为工艺因素，每个因素采用3个水平，选择L9（34）正交表进行实验，同时用硫酸-苯酚法测定甘草多糖的含量来作为综合评价指标。在超声条件下提取甘草多糖的适宜条件为：提取次数为3次，提取时间为20min，提取温度为45℃，料液比为1:20（g/ml），该提取条件下甘草多糖的含量为2.39％。利用超声提取多糖，相对其他提取方法有较大优势，可缩短提取时间、提高提取效率，且操作方便、自动化程度高，便于大规模工业生产。1.2.3.4微波提取微波是一种电磁波,其原理是运用三百兆赫到三百千兆赫之间的电磁波产生的电磁场,穿过细胞壁到达内部有效成分,由于植物内部微管束和溶剂吸收了微波能,使其温度迅速上升,溶剂亦转变为高能量不稳定的激发态。为了能够释放能量而在此变为基态,导致压力不断上升,涨破细胞壁使其破裂,则内部有效成分与溶剂相混合并被提取出来。微波提取的有点显著,有耗时短,溶剂用量小,污染较少,加热均匀,热效率高等[28,29]。陈湘，冯巧等研究了微波提取法提取黄蘑多糖[30]，考察了微波功率、料液比和微波时间对多糖产率的影响。实验结果表明，提取黄蘑多糖的最佳工艺条件为：微波功率600w，微波时间8min，料液比l：30g／mL。在此条件下，多糖产率14．17％。与传统热水提取法相比，多糖产率提高了3．35％，且提取时间大大缩短，降低了能耗，是一种较好的提取黄蘑多糖的新工艺。1.2.3.5超临界萃取当流体的温度和压力分别处于它的临界温度和压力以上时，称该流体处于超临界状态。在这种状态下，它既不完全与一般气相相同，又不是液相，故称为超临界流体。超临界流体兼有气相、液相的特点。它既有与气体相当的高渗透力和低黏度。又兼有与液体相近的密度和对物质优良的溶解能力，这种溶解能力能随体系参数的变化而连续地改变，因而可以通过改变体系的温度和压力，方便地调节组分的溶解度和萃取的选择性。利用上述特点，超临界二氧化碳萃取主要分为2类原理流程，即恒温降压流程和恒压升温流程。前者萃取相经减压，后者萃取相经升温，都使超临界流体丧失对溶质的溶解能力，达到分离溶质和回收溶剂的目的。溶剂经增压或降温后循环使用。适用于超临界流体萃取的溶剂有乙烯、二氧化碳、乙烷、丙烷、氮、正庚烷、甲苯等，工业上CO2是常用的溶剂。赵煜等[31]通过对超临界二氧化碳，萃取当归油的工艺及当归多糖提取的研究，采用正交试验探讨了不同压力、温度、流量等因素对当归油萃取率的影响¨引。结果表明，当萃取压力为25MPa、萃取温度为45℃、CO，流量为40L／h，萃取时间2h时，当归油得率最高；当归多糖的最佳提取工艺参数为固液比(M／V)1：6，浸提时间2h，醇沉浓度60％，浸提温度85℃，此时当归总多糖得率为14．32％。CO2作为超临界萃取流体，它具有许多独到之处，例如临界点容易达到，一般情况下不与被萃取物发生反应，无色，无味，无毒，无臭，使用安全，不易燃，易去除，易回收，价廉，对环境不产生污染，有抑菌效果。因此，它在轻工、食品、医药等领域得到广泛应用。与常用的蒸馏、萃取、吸收等单元操作相比，超临界二氧化碳萃取技术具有萃取回收率高、产品质量好等优点，适合于分离含热敏性组分的物质和生理活性物质，节省耗能，保护环境。四川理工学院本科毕业论文实验部分第二章实验部分2.1实验试剂及仪器2.1.1实验试剂实验中所用药品见表2-1。表2-1实验所用试剂名称规格厂家苯酚AR分析纯成都市科龙化工试剂厂浓硫酸AR分析纯重庆川东化工集团有限公司无水乙醇AR分析纯重庆川东化工集团有限公司纤维素酶AR分析纯湖南新鸿鹰生物工程有限公司果胶酶AR分析纯湖南新鸿鹰生物工程有限公司无水葡萄糖AR分析纯曹杨第二中学化工厂2.1.2实验仪器实验所用仪器见表2-2。表2-2实验所用仪器名称型号厂家分光光度计UV754N上海棱光技术有限公司恒温水浴锅DZKW-D-2北京永光明医疗仪器有限公司调温电热套ZDHW北京中兴伟业仪器有限公司粉碎机FW117型上海科恒实业发展有限公司精密鼓风干燥箱WGZ型上海科恒实业发展有限公司循环水式真空泵SHZ-D（Ⅲ）巩义市予华仪器有限责任公司台式电动离心机80-2型金坛市科析仪器有限公司2.1.3实验原料及处理方法本实验采用新鲜的柠檬香蜂草叶作为实验原料。处理方法如下：将新鲜的柠檬香蜂草叶清洗干净，摘去烂叶。放入干燥箱，先于100℃干燥20min，快速除去大量水分。再于50℃干燥10h，持续出去剩余水分，得干燥叶片。将干燥过的柠檬香蜂草叶片放入粉碎机粉碎，收集瓶中，冷藏备用。2.2实验方案2.2.1多糖含量测定方法本实验采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。[29]精密称取无水葡萄糖对照品50.75mg置于50ml容量瓶，加水定容。精密称取上述溶液1ml，定容至10ml容量瓶，即得0.105mg/ml标准品溶液。测定方法如下：用移液管精密称取0.1~0.6ml葡萄糖标准溶液，分别置于10ml比色管中。2.依次加水使之成为2ml。3.另加1.0ml6％的苯酚，摇匀。4.迅速滴加浓硫酸各5ml，摇匀。5.在沸水中加热20min，冷却5min6.以空白校正零点，于490nm处检测其吸光度。绘制标准曲线，得回归方程为y=54.308x+0.0644，相关系数R²=0.9902。图2-1苯酚硫酸法测多糖标准曲线样品溶液的测定：将所得多糖粗品定容至250ml容量瓶。取该溶液0.5ml于试管，按上述步骤操作，测其吸光度，用标准曲线计算多糖浓度，再由多糖浓度计算多糖提取率。2.2.2柠檬香蜂草中多糖提取试验研究2.2.2.1多糖提取流程图香蜂草干燥粉碎热水浸提（或酶提取）香蜂草干燥粉碎热水浸提（或酶提取）过滤滤液定容装入试管无水乙醇沉淀静置离心其去上清液多糖粗品2.2.2.2热水浸提香蜂草中多糖研究热水浸提多糖操作方法取香蜂草干燥粉末5g，放入圆底烧瓶，加入蒸馏水，按照一定溶剂用量、温度、时间进行水浴回流提取，放冷后滤纸过滤，弃去残渣，得多糖提取液[33]。提取液置于100ml容量瓶中加水定容，精密称取2ml于试管，加入18ml无水乙醇，摇匀，静置过夜。离心机（4000r/min）20min，弃去上清液，得多糖粗品。（2）热水浸提香蜂草多糖正交试验采用L9（34）正交表，以溶剂用量（香蜂草质量/溶剂体积g/v）、提取时间、提取温度作为三因素做正交试验。因素水平表如表2-3所示：表2-3热水浸提香蜂草多糖正交试验因素水平表因素水平ABC溶剂用量（g/ml）温度（℃）时间（h）11:1060121:2080231:301003（3）提取次数对香蜂草多糖提取的影响选取柠檬香蜂草5g，溶剂用量1：20、提取温度100℃、提取时间2h，将分别进行1次、2次、3次提取，研究提取次数对香蜂草多糖提取的影响（4）溶剂用量对香蜂草多糖提取的影响选取柠檬香蜂草5g，提取温度100℃、提取时间3h，溶剂用量分别取1:5、1:10、1:15、1:20，研究溶剂用量对香蜂草多糖提取的影响。2.2.3.3酶提取法提取香蜂草多糖研究纤维素酶提取多糖操作方法取5g柠檬香蜂草置于圆底烧瓶，加水100ml。在恒温水浴锅内，于80℃加热30min。降温至40/50/60℃，添加0.01/0.02/0.03g纤维素酶，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调节PH至4/4.5/5，保温1/2/3h。调节水浴锅，升温至80℃灭酶，保持30min。滤纸过滤，去残渣，得多糖提取液[34]。将所得提取液置于100ml容量瓶中加水定容，精密称取2ml于试管，加入18ml无水乙醇，摇匀，静置过夜。离心机（4000r/min）20min，弃去上清液，得多糖粗品。（2）纤维素酶提取多糖正交试验本实验采用L9（34）正交表，以对酶作用的PH值，提取时间，提取温度，加酶量作四因素正交试验[35]。因素水平表如表2-4所示：表2-4酶提取法（纤维素酶）提取香蜂草多糖正交试验因素水平表因素水平ABCDPH温度（℃）加酶量（g）时间14400.01124.5500.02235600.033（3）果胶酶提取多糖操作方法取5g柠檬香蜂草置于圆底烧瓶，加水100ml。在恒温水浴锅内，于80℃加热30min。降温至40/50/60℃，添加0.01/0.02/0.03g果胶酶，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液，调节PH至4/4.5/5，保温1/2/3h。调节水浴锅，升温至80℃灭酶，保持30min。滤纸过滤，去残渣，得多糖提取液。将所得提取液置于100ml容量瓶中加水定容，精密称取2ml于试管，加入18ml无水乙醇，摇匀，静置过夜。离心机（4000r/min）20min，弃去上清液，得多糖粗品。（4）果胶酶提取多糖正交试验本实验采用L9（34）正交表，以对酶作用的PH值，提取时间，提取温度，加酶量作四因素正交试验。因素水平表如表2-5所示：表2-5酶提取法（果胶酶）提取香蜂草多糖正交试验因素水平表因素水平ABCDPH温度（℃）加酶量（g）时间14400.01124.5500.02235600.033四川理工学院本科毕业论文实验结果与讨论第三章实验结果与讨论3.1多糖提取工艺研究3.1.1热水浸提香蜂草多糖的研究3.1.1.1提取次数对多糖提取的影响称取柠檬香蜂草5g，选取溶剂用量1：20、温度100℃、时间2h，将滤渣分别进行2次、3次提取，结果如表3-1所示：表3-1提取次数对香蜂草多糖提取的影响提取次数123∑多糖提取率％2.630.890.253.77提取效率％69.723.66.7100由表可知，经过前两次提取，提取率就可达到93.3％。而第三次提取需要花费同样的时间，提取效率却只有6.7％，提取效率低，花费的时间成本与效率不成比例，在实际生产中不推荐使用。故提取次数应为2次。3.1.1.2溶剂用量对多糖提取的影响称取柠檬香蜂草5g，选取温度为100℃，提取时间为3h，选定溶剂用量分别为1:5/1:10/1:15/1:20，结果见图3-1：图3-1溶剂用量对多糖提取的影响由图3-1可知，当溶剂用量低于1:15时，提高溶剂用量，多糖提取率会有明显提高。而当溶剂用量高于1:15时，无显著提高。3.1.1.3热水浸提香蜂草多糖的正交试验本实验采用L9（34）正交表，结合上述单因素分析作正交试验。试验结果及极差分析见表3-2，方差分析结果见表3-3：表3-2热水浸提香蜂草多糖的正交试验结果因素ABC实验溶剂用量温度提取时间提取率（g/ml）（℃）（h）（％）11:108011.2421:109021.5931:1010032.1641:158021.7251:159031.8861:1510012.5771:208031.8381:209011.7191:2010022.63K14.994.795.52K26.175.185.94K36.177.365.87`K11.66331.59671.8400`K22.05671.72671.9800`K32.05672.45331.9567Rj0.39330.85670.1400优水平A2B3C2其中K为同一水平的三组对应因素的提取率之和，`K为K的平均值，即：K1=1.24+1.59+2.16=4.99，`K1=1.6633K2=1.72+1.88+2.57=6.17，`K2=2.0567K3=1.83+1.71+2.63=6.17，`K3=2.0567由表3-2可知，假如因素A对多糖提取率无影响，那么`K1`K2`K3的值应该相等，而实际上`K1＜`K2=`K3，这显然是由于因素A的水平变化引起的。因此`K1`K2`K3的大小反映了因素A的三个水平对多糖提取率的影响大小。由于希望多糖提取率越大越好，且因为`K2=`K3，基于节省成本的考虑，应取A2作为A因素的优水平。同理可知，因素B、C的优水平应为B3和C2，优水平组合为A2B3C2。Rj=K均值max－K均值min，Rj越大，代表该因素在实验范围内变化时，使提取率的数值变化越大，该因素也越重要。根据Rj的定义计算，可知：A因素的Rj=2.0567-1.6633=0.3933B因素的Rj=2.4533-1.5967=0.8567C因素的Rj=1.9800-1.8400=0.1400比较Rj值可以得出，B因素的Rj值最大，即提取温度对多糖提取率的影响最大，而C因素的Rj值最小，即提取时间对多糖提取率的影响最小。综上，影响多糖提取率的各个因素排序为：提取温度（B）＞溶剂用量（A）＞提取时间（C）。故热水浸提多糖的最佳工艺为溶剂用量：1:15、提取温度：100℃、提取时间：2h。表3-3热水浸提香蜂草多糖正交试验的方差分析方差来源离差平方和SS自由度df方差MsF值显著性A（溶剂用量）0.309420.154711.4507B（温度）1.278820.639447.3248*C（时间）0.033820.01691.2492误差e0.027020.0135总离差SST1.6490注：Fa0.05（2,2）=19；Fa0.01（2,2）=99其中，总离差平方和SST为：（xi为第i组实验的多糖提取率，`x为9组多糖提取率的和的平均值）因素引起的离差平方和公式为：（n=实验总次数=9；r=因素水平数=3；`Ki=某因素第i个`K值）A因素离差平方和为：同理可知，SSB=1.2788，SSC=0.0338，SSe=0.0270.总离差平方和的自由度所以A因素方差同理可知，同理可得FA＜Fa0.05（2,2），Fa0.05（2,2）＜FB＜Fa0.01（2,2），FC＜Fa0.05（2,2）所以B因素显著，A、C因素不显著，即温度对多糖提取达到显著水平，溶剂用量和时间对多糖提取影响不显著，因素作用的主次序为B、A、C。3.1.2酶提取香蜂草多糖的研究3.1.2.1纤维素酶提取多糖的正交试验本实验采用L9（34）正交表，以酶作用PH值、提取时间、提取温度、加酶量作为四因素，作正交试验。试验结果及极差分析见表7，方差分析结果见表3-4：表3-4纤维素酶提取香蜂草多糖的正交试验结果因素ABCD实验PH温度加酶量提取时间提取率（℃）（g）（h）（％）14400.0111.9724500.0222.5434600.0332.3744.5400.0232.9254.5500.0312.9764.5600.0123.0775400.0321.6485500.0131.9495600.0212.19K16.886.536.987.12K28.957.457.657.25K35.787.636.987.23`K12.29732.17562.32592.3766`K22.98422.48402.55152.4180`K31.92542.54382.32592.4088Rj1.05880.36830.22560.0414优水平A2B3C2D2由表3-4可知，以B因素为例：K1=1.97+2.92+1.64=6.53，`K1=2.1756K2=2.54+2.97+1.54=7.45，`K2=2.4840K3=2.37+3.07+2.19=7.63，`K3=2.5438假如因素B对多糖提取率无影响，那么`K1`K2`K3的值应该相等，而实际上`K1＜`K2＜`K3，这显然是由于因素B的水平变化引起的。因此`K1`K2`K3的大小反映了因素B的三个水平对多糖提取率的影响大小。由于希望多糖提取率越大越好，应取B3作为B因素的优水平。同理可知，因素A、C的优水平应为A2和C2，优水平组合为A2B3C2D2。根据Rj的定义计算，可知：A因素的Rj=2.9842-1.9254=1.0588B因素的Rj=2.5438-2.1756=0.8567C因素的Rj=2.5515-2.3259=0.2256D因素的Rj=2.4180-2.3766=0.0414比较Rj值可以得出，A因素的Rj值最大，即酶作用PH对多糖提取率的影响最大，而D因素的Rj值最小，且与其他三因素差距较大，即提取时间对多糖提取率的影响极小。综上，影响多糖提取率的各个因素排序为：酶作用PH（A）＞提取温度（B）＞加酶量（C）＞提取时间（D）。故纤维素酶提取多糖的最佳工艺为酶作用PH：4.5、提取温度：60℃、加酶量：0,02g、提取时间：2h。表3-5纤维素酶提取香蜂草多糖正交试验的方差分析方差来源离差平方和ss自由度df方差MsF值显著性A（PH）1.733420.8667610.4478**B（温度）0.234320.117282.5524*C（加酶量）0.101820.050935.8358误差e0.002820.0014总离差SST2.0724注：Fa0.05（2,2）=19；Fa0.01（2,2）=99其中，总离差平方和SST为：（xi为第i组实验的多糖提取率，`x为9组多糖提取率的和的平均值）因素引起的离差平方和公式为：（n=实验总次数=9；r=因素水平数=3；`Ki=某因素第i个`K值）B因素离差平方和为：同理可知，SSA=1.7344，SSC=0.1018，SSe=0.0028.总离差平方和的自由度所以B因素方差可得可得FA＞Fa0.01（2,2），Fa0.05（2,2）＜FB＜Fa0.01（2,2），Fa0.05（2,2）＜FC＜Fa0.01（2,2）所以A因素极显著，B、C因素显著，即酶作用PH对多糖提取达到极显著水平，提取温度和加酶量对多糖提取影响显著，而提取时间由于对实验结果影响极小。因素作用的主次序为A、B、C、D。3.1.2.2果胶酶提取多糖的正交试验本实验采用L9（34）正交表，以酶作用PH值、提取时间、提取温度、加酶量为四因素，作正交试验。试验结果及极差分析见表3-6，方差分析结果见表3-7：表3-6果胶酶提取香蜂草多糖的正交试验结果因素ABCD实验PH温度加酶量提取时间提取率（℃）（g）（h）（％）14400.0111.2524500.0221.6234600.0331.58续表3-6果胶酶提取香蜂草多糖的正交试验结果44.5400.0231.8954.5500.0311.9464.5600.0122.0175400.0321.3285500.0131.1495600.0211.43K14.444.464.404.63K25.854.704.944.95K33.895.034.844.61K1均值1.48041.48501.46441.5418K2均值1.95001.56791.64771.6508K3均值1.29781.67531.61391.5357Rj0.65210.19030.18110.1151优水平A2B3C2D2由表3-6及其续表可知，以A因素为例：K1=1.25+1.62+1.58=4.44，`K1=1.4804K2=1.89+1.95+2.01=5.85，`K2=1.9500K3=1.32+1.14+1.43=3.89，`K3=1.2978假如因素A对多糖提取率无影响，那么`K1`K2`K3的值应该相等，而实际上`K3＜`K1＜`K2，这显然是由于因素A的水平变化引起的。因此`K1`K2`K3的大小反映了因素A的三个水平对多糖提取率的影响大小。由于希望多糖提取率越大越好，应取A2作为C因素的优水平。同理可知，因素B、C、D的优水平应为A2、B3、D2，优水平组合为A2B3C2D2。根据Rj的定义计算，可知：A因素的Rj=1.9500-1.2978=0.6521B因素的Rj=1.6753-1.4850=0.1903C因素的Rj=1.6477-1.4644=0.1811D因素的Rj=1.6508-1.5357=0.1151比较Rj值可以得出，A因素的Rj值最大，即酶作用PH对多糖提取率的影响最大，而D因素的Rj值最小，即提取时间对多糖提取率的影响极小。综上，影响多糖提取率的各个因素排序为：酶作用PH（A）＞提取温度（B）＞加酶量（C）＞提取时间（D）。故纤维素酶提取多糖的最佳工艺为酶作用PH：4.5、提取温度：60℃、加酶量：0,02g、提取时间：2h。表3-7果胶酶提取香蜂草多糖正交试验的方差分析方差来源离差平方和ss自由度df方差MsF值显著性A（PH）0.679120.339627.0007*B（温度）0.055620.02782.2116C（加酶量）0.054620.02732.1711误差e0.025220.0126总离差SST0.8145注：Fa0.05（2,2）=19；Fa0.01（2,2）=99其中，总离差平方和SST为：（xi为第i组实验的多糖提取率，`x为9组多糖提取率的和的平均值）因素引起的离差平方和公式为：（n=实验总次数=9；r=因素水平数=3；`Ki=某因素第i个`K值）B因素离差平方和为：同理可知，SSB=0.0556，SSC=0.0546，SSe=0.0252.总离差平方和的自由度所以A因素方差可得可得Fa0.05（2,2）＜FA＜Fa0.01（2,2），FB＜