基于表面等离子体共振生物传感器的2,4二硝基苯检测模型的建立

基于表面等离子体共振生物传感器的2,4二硝基苯检测模型的建立

在空间结构的过程中，液体层的一些生化指标与生理功能密切相关。因此,在美国的天空实验室、航天飞机、空间实验室等飞行中备有专门的血样、尿样收集装置,飞行结束后将样品带回地面进行检测。但该方法对航天员的健康监测有一定的滞后性,无法针对特殊情况及时采取应对措施。如能实时监测同机体健康状态相关的生化指标,对于研究空间因素对机体影响的机制并及时采取措施,保障航天员的健康和工作效率具有重要意义。建立航天员体液在线监测系统,生物传感器技术是可选择的途径之一。其中,表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)生物传感器因具有灵敏、实时、样品无需预处理、操作简便、抗干扰能力强等优点,已在生命科学研究、食品及饮料质量检验等领域得到广泛应用。由于其检测原理是非力学依赖性的,可应用于微重力环境,对空间飞行中航天员体液的在线监测有重要意义。然而低分子量且低质量浓度的分析物,如体液中的激素、小肽等,检测灵敏度不够高。为提高小分子的检测灵敏度,本实验室根据抑制性免疫检测原理,在以SPR传感器为核心的便携式生物分子在线分析系统(portableonlinebio-moleculesanalyzer,POBA)的基础上,以2,4-二硝基苯肼(DNPH)检测为模型,筛选得到了灵敏、快速、稳定的生物分子膜制备及小分子检测体系。将该技术进一步完善与发展,可望应用于空间飞行中航天员体液在线监测。dnph、bsa和体外生物分子膜的制备仪器图1为便携式生物分子在线分析系统构成示意图。其核心是SPR生物传感器,根据检测需要在其测试面制备不同的生物分子膜,组装到一体化流过池内用于检测。整个系统可应用于生物分子浓度的自动化检测。试剂2,4-二硝基苯肼(2,4-Dinitrophenylhydrazine,DNPH,C6H6N4O4)、4-羟基-3甲氧基-苯乙二醇(4-hydroxy-3-methoxy-phenylglycol)、3,4-二羟基苯乙二醇(3,4-Dihydroxy-phenylglycol)、2,4-二硝基苯酚-L-细胞溶解酶(2,4-DNP-L-Lysin)、3-甲氧基-酪氨酸(3-methoxytyramine)、Nε-3-羟基-酪氨酸盐酸(Nε-3-hydroxy-tyramin-hydrochorid)、胎牛血清白蛋白(BSA)、胎牛甲状腺球蛋白(BTG)均购自Sigma公司。DNP抗体由本实验室自制。生物分子膜的制备滴加DNP-BSA溶液于洁净的SPR传感器测试面,空气中自然干燥,40℃固化,超纯水冲洗,即完成生物分子膜的制备。DNPH的检测200μg/ml的DNP单克隆抗体倍比稀释,依次泵入反应池并停留5min,缓冲液冲洗至折射率曲线平稳。以抗体浓度为横坐标,折射率(refractiveindex,RI)变化值为纵坐标,作标准曲线。在线性范围较好的区间选择适当的抗体浓度。4μg/mlDNPH倍比稀释,浓度范围在2ng/ml～4μg/ml,分别与等体积的100μg/ml的抗体混匀,室温下充分反应。泵入反应池内停留5min,缓冲液冲洗至折射率曲线平稳,记录样品加入前后的RI变化值。生物传感器再生每检测完一个样品,泵入再生液,洗去与DNP-BSA结合的抗体,PBS缓冲液冲洗至RI曲线平稳。dnph与抗体检测能力的相关性生物分子膜的制备用DNP-BSA制备生物分子膜后,RI升高8.84×10-4。为检测制备效果,将3%BSA溶液泵入反应池并停留60min,反应前后RI无变化(曲线未显示)。DNPH的检测区间不同浓度抗体流经反应池引起的折射率变化如图2(a),作标准曲线如图2(b)。抗体浓度在0～100μg/ml范围内,与折射率变化的线性相关性较好。为了提高检测的准确性,抗体浓度不应过低,确定其使用浓度为50μg/ml。不同浓度的DNPH与抗体溶液充分反应后流经反应池引起的折射率曲线变化如图3(a),做标准曲线如图3(b)。计算得到DNPH的线性范围为7.8ng/ml～2μg/ml,检测下限为2.5ng/ml。作为参照,第一个与最后一个样品为25μg/ml的DNP抗体,二者折射率分别为1.969×10-4和1.845×10-4。传感器重复性连续测定35μg/ml抗体50次,RI变化为(3.416±0.253)×10-4,相对标准偏差(RSD)为7.39%,第50次RI变化值比第1次下降7.2%。图4为传感器连续10次检测曲线。dnph与srp的定量检测利用SPR生物传感器直接检测生物分子,常面临如下问题:1)某些分子量小、含量低的生物分子,在传感器测试面结合后的响应信号小,灵敏度差;2)预先固化在传感器上的抗体常温下易失活,不适用于航天、野外等特殊环境。为提高灵敏度,目前常用的方法有:1)在直接法检测系统中引入生物素-亲合素;2)待测分子结合在生物分子膜后再结合其配体,利用夹心法提高检测灵敏度;3)用胶体金、脂质体标记待测小分子,以放大响应信号。但上述方法不适用于DNPH的快速、便携检测。DNPH分子很小,仅有1个抗原表位,无法用夹心法测定;对它进行标记,步骤繁琐,不能在野外、空间等特殊环境下简便的实现,且操作过程会造成检测结果的误差。针对以上原因,本实验室采用抑制性免疫检测法,通过溶液中过剩的抗体浓度反映待测生物分子的浓度,实现了小分子的灵敏检测。固化在测试面上的抗原常温下能长时间保持其免疫原性,适用于此类小分子半抗原。本实验室用抑制性ELISA方法检测DNPH,其线性范围为7.8ng/ml～2μg/ml,检测下限为1.7ng/ml;二者检测灵敏度基本相同,而SRP技术还具有实时、不受力学因素影响、仪器易实现自动化、便携化等优点,在空间环境中应用具有重要意义。理论上,若能彻底去除结合抗体且不影响抗原在传感器生物分子膜的活性,此传感器生物分子膜可反复使用。实验证明:1)样品浓度越低,与膜表面的生物分子作用时间越长,导致的RI变化越大,再生所需时间就越长;2)新制备的生物分子膜,前几次再生需时较短,其后,再生时间在一定范围内不会对基线造成影响(曲线未显示);3)若前一样品引起的RI上升很小,是否再生对下一样品的检测影响不大;4)在可选择范围内,再生时间宜短不宜长。分析认为,样品在反应池内停留仅几分钟,生物分子膜远没达到饱和,只需保证再生后测试面的抗原结合能力远大于抗体结合所需量即可。既避免破坏生物分子膜,又缩短了检测总时间。重复性实验结果表明传感器的再生方法基本满足多样品检测的需求。为了进一步提高检测的准确性和可信度,可通过改变再生液成分、PH值、调整再生时间和流速等方法对其进行优化。为评价该方法检测特异性,表1列出了相同摩尔浓度的DNPH类似物与抗体混合溶液流经传感器所引发的RI变化值。由结果可见,含间位硝基苯环的一类化合物引发的RI变化最小,说明其能与抗体特异性结合;含苯环或硝基基团的类似物及载体蛋白BSA、BTG引发RI变化与抗体引发RI变化基本或完全相同,说明它们与抗体无反应,这与抗体的特异性相符合。因此,用DNP-BSA制备生物分子膜不会造成检测的非特异性,后者主要决定于所用抗体的特异性。结果显示,一个样品的检测包括样品结合、PBS冲洗和传感器再生3个步骤。样品在反应池中反应5min,PBS冲洗2min,再生时间因具体情况5～10min不等,每个样品的检测需时平均15min,检测需时较短。实际样品检测便携式生物分子在线分析系统根据光学信号变化反映分子浓度,不受电、磁、力干扰,适用于空间环境;能实时分析生物分子间相互作用,检测结果最终转化为电信号,与航天员的生理信息一同传输给地面医监人员,据此对航