第十二章 真核生物的基因调控

第十二章

真核生物的基因调控一真核细胞的基因结构真核细胞与原核细胞在基因转录、翻译及DNA的空间结构方面存在很大的差异，主要表现在以下几个方面：1在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，即基因以多顺反子的形式存在。2真核细胞DNA与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。3真核细胞中有一部分由几个或几十个碱基组成的DNA序列，在整个基因组中重复几百次甚至上百万次。高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的。大部分真核细胞的基因中存在不被翻译的内含子。4真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片断的重排，在需要时，可增加细胞内某些基因的拷贝数。5真核生物中，基因转录的调节区较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，它主要是通过改变整个所控制基因5ˊ上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。6真核生物的RNA在细胞核中合成，只有穿过细胞膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质。7许多真核细胞的基因需经过复杂的成熟和剪接过程（maturationandsplicing）才能顺利地翻译成蛋白质。二基因家族(genefamily)原核细胞中，整个体系置于一个启动子控制之下。由于真核细胞的DNA都是单顺反子，许多相关的基因常常按功能成套组合，一套基因就是一个基因家族。家族中各成员的表达水平和酶活性可以很不相同，但通常是密切相关的。通常分为简单多基因家族、复杂多基因家族和发育调控的复杂多基因家族。1简单多基因家族：指在家族中有一个或数个基因以串联方式重复排列。如编码ssrRNA的基因家族，其中每个ssrRNA基因都被规模宏大的间隔序列所分开。间隔序列的长度约为ssrRNA长度的2—6倍，并含有中等重复序列，每个ssrRNA基因都被单独转录，产生独立于其它部分的RNA分子，经加工为成熟的ssrRNA。2复杂多基因家族：一般由几个相关基因家族构成，基因家族之间由间隔序列隔开，并作为独立的转录单位。如：海胆的组Pr基因家族。

组蛋白（海胆）

组蛋白（果蝇）3发育调控的复杂多基因家族在生物体发育的不同阶段，复杂多基因家族中的基因结构和数量，会发生变化的情况，基因之间存在着具有调节功能的重复序列。在每个基因家族中，基因排列的顺序就是它们在发育阶段的表达顺序。如人类的血红蛋白，在母体怀孕后的不同时期出现不同的亚基和数量变化。三真核基因的断裂结构1外显子和内含子：现已查明，大多数真核基因都是由Pr编码序列和非Pr编码序列组成。编码序列称为外显子（exon），非编码序列称为内含子（intron）。在一个结构基因中，编码某一Pr不同区域的各个外显子并不连续地排列在一起，而常常被长度不等的内含子所隔离，形成镶嵌排列的断裂方式，所以真核基因有时称为断裂基因(interruptedgene)。只有真核基因具有切除基因中内含子，产生功能型mRNA和Pr的能力，原核生物不具有此种特性。观察研究外显子和内含子的方法：1.电子显微镜：将成熟mRNA分子和相应的染色体DNA进行分子杂交，形成DNA-RNA异源双链分子（heterdaplexes）,在电镜下可观察到部分单链DNA区段从异源双链分子上呈环状突起，表示这序列在成熟mRNA分子上已被切除，为内含子。2.用S1核酸酶处理异源双链分子：S1核酸酶能专一降解未配对的单链核苷酸，基因组DNA中只有与成熟mRNA链相对应的片断，由于形成异源杂合体而得以保留。这些保留下来的DNA片断就是外显子。根据对全序列的分析，它们的大小和在DNA链上的特定位置都能被精确地测定。3限制性内切酶切图谱分析：采用几种不同的限制性内切酶，综合分析DNA的酶切图谱和成熟mRNA分子一的酶切位点的分布，就可确定内含子的大小及其在基因中与外显子的排列方式。2外显子与内含子的可变性：在基因转录、加工产生成熟mRNA分子时，内含子通过剪接加工被去除，保留在成熟mRNA分子中的外显子被拼接在一起，最终被翻译成蛋白质。因此，通过反转录酶的作用，由成熟mRNA产生的cDNA分子中，只含有外显子，没有内含子。外显子和内含子的关系并不是完全固定不变的，有时会出现这样的情况：在同一条DNA链上的某一段DNA序列，它作为编码茉一条多肽链基因的一部分时是外显子，但作为编码另一条多肽链基因的一部分时，则成了内含子，这是由于mRNA剪接加工的方式不同造成的。其结果是同一段DNA序列加工生成了两条或两条以上的mRNA链。3外显子与内含子的连接区：真核基因断裂结构的另一个重要特点是外显子-内含子连接区（exon-intronjunction）的高度保守性和特异性碱基序列。外显子-内含子连接区就是指外显子和内含子的交界，又称边界序列。有两个重要特征：1.内含子的两端序列之间没有广泛的同源性，因此内含子两端序列不能互补，即上游序列和下游序列不可能通过碱基配对形成发卡式二级结构。2.外显子-内含子连接区很短，但却高度保守（consensussequence），它是RNA剪接的信号序列。序列分析表明：几乎每个内含子5ˊ端起始的两个碱基都是GT，3ˊ端最后两个碱基总是AG，由于这两个碱基的高度保守性和存在的广泛性，将其称为GT-AG法则，即5ˊGT…AG3ˊ。四真核生物DNA水平的调控1基因丢失：某些原生动物、昆虫及甲壳纲动物细胞分化过程中发现有部分染色体丢失的现象。这种方式仅存在于进化程度较低的生物中，如马蛔虫。2基因扩增：指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要。是基因活性调控的一种方式。如：非洲爪蟾的卵母细胞中原有rRNA（rDNA）基因约500个拷贝，在减数分裂Ⅰ的粗线期内，这个基因开始迅速复制，到双线期，其copy数达200万个，增加近4000倍，可用来合成1012个rRNA，以满足卵裂期间和胚胎期间合成大量Pr的需要。3.基因重排与变换：一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录，这种方式称基因重排。典型的例子是小鼠免疫球Pr结构基因的表达，免疫球Pr肽链主要由可变区、恒定区及两者之间的连接区组成，在未分化的细胞中（胚胎细胞中）三者相距较远。当淋巴细胞发育分化时，能通过染色体内的重组，把三个远离的基因紧密地连接在一起，从而产生免疫球Pr。

基因的重排与变换

一个基因可以通过从远离其启动子的地方移到距它很近的位点而被启动转录，这种方式称为重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是小鼠免疫球蛋白结构基因的表达。

VDJCμCα

E未分化细胞

VDJCμCα

E

产生Cμ细胞VDJCαE产生Cμ细胞类型转换

免疫球蛋白中连基因的组织特一行表达与基因重排V.可变区;D.多态区;J.结合区

五顺式作用元件与基因调控1染色质结构对转录的影响：转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋或松驰，形成自由DNA。这种变化包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化如双螺旋的局部超旋或松驰，DNA从B-DNA变为Z-DNA等。这些变化导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，从而导致基因的转录。1、染色体水平的调控

A、染色体结构的改变Tu1Tu2

染色质结构变化影响基因转录染色质去超螺旋基因转录

真核基因的活跃转录是在常染色质上进行的。转录发生之前，染色质常常会在特定的区域被解旋或松弛，形成自由DNA。这种变化可能包括核小体结构的消除或改变，DNA本身局部结构的变化，如双螺旋的局部超旋或松弛，DNA从右旋型变为左旋型（Z-DNA）等。这些变化可导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，从而导致基因转录。多线染色体活跃表达的基因所在的染色质上含有对DNaseⅠ的超敏感位点(hypersensitivesite)，即率先降解位点。每个活跃表达基因都有一个或数个超敏感位点，大多位于基因5ˊ端启动区。每个超敏感位点是一段长约100-200bp的DNA序列。非活跃基因的5ˊ端相应位点不表现对DNaseⅠ的超敏感性。

3启动子及其对转录的影响：真核生物基因转录的起始位点具有“帽子”结构专一性，而且只有嘌呤（以腺嘌呤为主）才能起始转录。调控区较大，除具有结合RNA聚合酶Ⅱ的CAAT区之外，大多数基因还拥有GC区和增强子。几乎所有真核基因3ˊ端都存在一个poly（A）位点，该位点上游15-30bp处的保守序列AATAAA对于初级转录产物的准确切割及加poly（A）是必需的，初级转录产物的终止是AATAAA和终止区之间相互作用的结果。新生RNA在poly（A）位点的准确剪切加工则通过AATAAA区和poly（A）位点周围序列的相互作用来达到。真核生物的启动子：所谓启动子是指确保转录精确而有效地启始的DNA序列。真核基因启动子在由RNA聚合酶Ⅱ催化转录的DNA序列5ˊ上游区富含TA的保守序列，该序列前4个碱基为TATA，所以称为TATA框（TATAbox，或TATA区）。TATA区的主要作用是使转录精确地起始；CAAT区和GC区主要控制转录起始的频率，不参与起始位点的确定。现在认为启动子-25～-35区含有TATA序列，在-70～-80区有CCAAT序列（CAATbox），在-80～-110区含有GCCACACCC或GGGCGGG（GCbox）。习惯上将TATA区上游的保守序列称为上游启动子元件（upstreampromoterelement,UPF）或称上游激活序列（upstreamactivatingsequence,UAS）。Sequenceelementswithinatypicaleukaryoticgene1GCTATACAATGC-25-50-80-95-1301

basedonthethymidinekinasegene

octamertranscriptionelementpromoterTATAbox(TATAAAA)

locatedapproximately25-30bpupstreamofthe+1startsite

determinestheexactstartsite(notinallpromoters)bindstheTATAbindingprotein(TBP)whichisasubunitofTFIIDGCbox(CCGCCC)

bindsSp1(Specificityfactor1)

CAATbox(GGCCAATCT)

bindsCTF(CAATboxtranscriptionfactor)

Octamer(ATTTGCAT)

bindsOTF(Octamertranscriptionfactor)+1ATTTGCATRNA聚合酶II启动子

2增强子及其对转录的影响：增强子是指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。目前在病毒、植物、动物和人类正常细胞中都发现有增强子存在，是基因表达的重要调控元件。通常具有下列性质：a增强效应十分明显，一般能使基因转录频率增加10—200倍，有的可增加上千倍。B.增强效应与其位置和取向无关，不论增强子以什么方向排列（5ˊ→3ˊ或3ˊ→5ˊ），甚至和基因相距3000bp，或在基因的下游，均表现出增强效应。c.大多为重复序列，一般长约50bp，适合与某些蛋白因子结合。其内部常含有一个核心序列：（G）TGGA/TA/TA/T（G），该序列是在另一个基因附近产生增强效应时所必需的。d.其增强效应有严密的组织和细胞特异性，说明只有特定的Pr（转录因子）参与才能发挥功能。e.没有基因专一性，可在不同的基因组合上表现出增强效应。f.许多增强子还受外部信号的调控，如金属硫蛋白的基因启动区上游所带的增强子，就可以对环境中的锌、镉浓度做出反应。六反式作用因子对转录的调控反式作用因子也称转录因子，基因的所有顺式作用元件都要和相应的反式作用因子结合，并通过Pr之间的相互作用才能实现它们对基因的调控。顺式作用元件和反式作用因子结合形成转录复合体，根据各个Pr成分在转录中的作用，能将整个复合体分为3部分1.参与所有或某些转录阶段的RNA聚合酶亚基，不具有基因特异性。2.与转录的起始或终止有关的辅助因子，也不具有基因特异性。3.与特异调控序列结合的转录因子，具基因特异性，如TATA区。特异转录因子对基因表达的调控是大量的、广泛存在和高度有序的，主要有两种形式：1)转录起始复合物形成过程受到控制。2)通过专一因子的结合，提高RNA聚合酶起始转录活性。1CAAT区结合蛋白CTF/NF1：CTF和NF1是CAAT区的结合蛋白，是腺病毒复制所必需的。CTF/NF1是一组具双重功能的蛋白质，它们与CTTA区相结合，参与促进RNA聚合聚合酶Ⅱ指导的转录起始过程；当它们与其它相似于CAAT区的DNA序列相结合，则有利于起始DNA的复制。2TATA和GC区结合蛋白：TATA和GC区结合蛋白主要是RNA聚合酶Ⅱ起始一般基因转录所必需的4种Pr因子，有TFⅡD、TFⅡA、TFⅡB、TFⅡE。TFⅡD：与TATA区相结合。TFⅡA：参与TFⅡD和TATA区的结合。TFⅡB：帮助RNA聚合酶Ⅱ与启动区结合。TFⅡE：帮助RNA聚合酶起始基因转录。表RNA聚合酶Ⅱ的基本转录因子转录因子分子量(kD)功能TBP30与TATA盒结合TFⅡ-B33介导RNA聚合酶Ⅱ的结合TFⅡ-F30,74解旋酶TFⅡ-E34,37ATP酶TFⅡ-H62,89解旋酶TFⅡ-A12,19,35稳定TFⅡ-D的结合TFⅡ-I120促进TFⅡ-D的结合PhosphorylationofthepolymeraseCTDbyTFIIHFormationofaprocessiveRNApolymerasecomplexandallowstheRNAPoltoleavethepromoterregion.Back3RNA聚合酶Ⅲ及其下游启动区结合蛋白：RNA聚合酶Ⅲ主要结合在转录起始位点的下游50bp以上区，有许多辅助因子参与RNA聚合酶Ⅲ对不同启动区的识别和结合，如转录因子TFⅢA参与该酶对非洲爪蟾5SrRNA的转录。TFⅢA具锌指结构域（锌指区Zincfingerregion）:TFⅢA蛋白有9个相似的重复单位，每个单位大约由30个AA残基组成，每个单位中有一对固定位点的半胱氨酸残基，一对固定的组AA残基，它们和Zn离子络合，使中间的AA残基回折成一种手指状结构，称锌指或锌指区。SP1锌指结构域Zincfingersmayformα-helicesthatinsertintothemajorgroove,associated

withβ-sheetsontheothersideThefirstfingerofasteroidreceptorcontrolsspecificityofDNA-binding(positionsshowninred);thesecondfingercontrolsspecificityofdimerization(positionsshowninblue).TheexpandedviewofthefirstfingershowsthatdiscriminationbetweenGREandEREtargetsequencesrestsontwoaminoacidsatthebase.4常见的反式作用因子中的DNA识别或结合域：1螺旋-转折-螺旋（helix-turn-helix,H-T-H）结构：这一类蛋白质分子中至少有两个α螺旋，中间由短侧链AA残基形成“转折”，近羧基端的α螺旋中氨基酸残基的替换会影响该蛋白质在DNA双螺旋大沟中的结合。Thehelix-turn-helixdomainHTH结构及其与DNA的结合2.锌指（Zincfinger）结构:锌指结构家族蛋白大体可分为锌指、锌钮（twist）和锌簇（cluster）结构，基特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。这类蛋白质与DNA的结合很牢固，特异性也很高。蛋白质的锌指结构Thezincfingerdomain

back…3.碱性-亮氨酸拉链(basic-leucinezipper):即bZIP结构。在许多调控蛋白中发现的一段富含亮AA的序列，这个区域易形成α螺旋或卷曲螺旋的构象，具有这种“拉链”形式的两个蛋白就能形成稳定的二聚体。拉链区以外的AA大都呈碱性，具的结合DNA的本领。Back…ThebasicregionsofthebZIPmotifareheldtogetherbythedimerizationattheadjacentzipperregion