显微镜直接计数法实验报告

显微镜直接计数法实验报告一、实验目的1、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。2、明确血细胞计数板的原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。二、实验原理

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。大多酵母菌以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖，有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。利用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为几个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图1，计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格，另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格400个，每一个大方格边长为1毫米，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1毫米，所以计数室的容积为0.1mm3（万分之一毫升）。

三、实验器材：1、菌种：酿酒酵母2、仪器或其他用品：血细胞计数板，显微镜，盖玻片，载玻片等四、实验步骤1、酵母菌出出芽方式的观察及死活鉴定（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种蘸取取少量液体酵母放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。注：染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上。注：盖玻片不宜平放，以免产生气泡。（3）将制片立即放在显微镜下镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。（4）将制片放置约5min后镜检，注意死细胞数量是否增加。（5）染色约30min后再次观察，注意死细胞数量是否增加。2、酵母菌子囊孢子的观察（1）涂片

在载玻片中央加一滴蒸馏水，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，混合均匀，染液不宜过多。（2）干燥固定

用夹子夹住载玻片，在酒精灯上方来回移动，注意不要将载玻片距离火焰太近，以免烫死酵母菌。（3）染色

用5%孔雀绿水溶液覆盖1.5～2min；水洗；95%乙醇脱色30s；水洗；0.5%番红水溶液覆盖1min；水洗；干燥。（4）镜检

将制好的装片放在显微镜下镜检，由低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。五、实验报告1、实验结果（1）酵母菌的死活鉴别时间立即观察5min后30min后死活情况少数死亡大部分死亡几乎全部死亡

（2）形态

酵母菌一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬性。菌落形态与细菌相似，但较大较厚，呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。五、注意事项：1.

锥形瓶中装入的液体培养基应不超过30%，避免加液量过多导致菌液内部缺氧。2.

培养时锥形瓶顶部不能用棉塞密封，应用纱布以保证更好的通透性。3.

从培养1的液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶，因为长时间培养后菌体会沉积到锥形瓶底部。

细胞粘附实验（显微镜直接计数）简介细胞粘附性是维持组织结构稳定的基本条件，也是细胞运动和发挥功能的调节因素，通常分细胞与细胞粘附和细胞与基质粘附。原理机体内许多细胞，如上皮细胞固定在某处发挥功能；另一些细胞，如白细胞，活跃运动，就需要不断调节细胞粘附。细胞粘附性的改变在肿瘤转移过程中也发挥着重要作用。恶性肿瘤具有从原发瘤分离及在体内扩散的能力，提示这些细胞相互识别及粘附机制发生了改变。用途药物实验、基因转染、敲除或培养，肿瘤转移机制材料与仪器待检测细胞、无菌6孔培养板、LipofectamineTM2000、37LRPsiRNA、培养箱、0.25%胰酶、无血清MEM培养基、Matrigel、96孔板、超净台、PBS或生理盐水、甲醇、姬姆萨染液、蒸馏水、显微镜。步骤1、将4.5×105个细胞每孔104左右传代于无菌6孔培养板中。2、培养24h后，用LipofectamineTM2000将37LRPsiRNA转染细胞中，转染后的细胞置37℃、5％CO2培养箱中培养，48h后收集细胞。同时各有两个平行孔的细胞进行阴性对照转染及未转染。转染终浓度即siRNA终浓度为100nmol/L。3、培养48h后收集细胞，用0.25%胰酶将贴壁培养细胞（约1×106个）从壁上消化下来并制成单细胞悬液。4、用无血清MEM培养基将Matrigel配制成10μg/250μl（1:300）的人工基底膜胶备用。5、96孔板每孔中铺Matrigel2μg/50μl，放于超净台中风干过夜。6、96孔板每孔加入适量无血清MEM细胞培养液（或PBS或生理盐水），放置60－90min，洗去多余的胶。7、取转染、阴性对照转染及未转染细胞以4×103/孔接种在铺胶的96孔板中，设3个重复孔，放入37℃、5％CO2培养箱中分别培养20min、40min、60min。8、在相应时间点取出96孔板，吸出培养液，用PBS洗3遍，洗去未粘附细胞。9、每孔加入100μl甲醇，固定15min。10、每孔加入100μl姬姆萨染液，染色15min，蒸馏水洗去染液。11、显微镜下计数粘附细胞数量（每孔在固定位置取