基于荧光碳点的葡萄糖中碳点与脱氧核糖核酸的相互作用

基于荧光碳点的葡萄糖中碳点与脱氧核糖核酸的相互作用

核酸存在于所有生物体中。这是生物因素的主要物质基础，与所有生命活动和代谢密切相关。它在储存、复制和传输遗传信息和生物合成信息方面起着重要作用。这对测定原子能也很重要。目前测定核酸的方法主要有分光光度法、荧光光度法、散射光法、电化学法等。碳点作为碳纳米家族中的一个新成员,具有激发波长和发射波长可调谐、荧光稳定性好等优异的荧光性能,而且还具有粒径和分子量均很小、生物毒性低等其他优点,因此可以作为量子点和有机染料的替代物而被广泛应用于生物成像、分析检测等领域。共振光散射(ResonanceLightScattering,RLS)技术是一项在普通荧光分光光度计上进行测量的分析技术,灵敏度高、简便快速。该技术可以用于生物大分子测定、药物分析、无机元素分析等多个研究领域。本文基于核酸与荧光碳点作用后共振光散射信号增强与核酸的浓度呈线性关系,据此建立了测定核酸的新方法。该方法简便可行,可以满足实际样品检测的需要。1实验部分1.1实验仪器和试剂LS-55荧光光度计(PerkinElmer公司);Sartorius普及型pH计(北京赛多利斯仪器系统有限公司);UV-2000型紫外-可见分光光度计(北京瑞利公司);TH-500A梯度混合器(上海青浦沪西仪器厂)。葡萄糖(北京博奥星生物科技有限公司);聚乙二醇、己二胺、鱼精脱氧核糖核酸(国药集团化学试剂有限公司);其他试剂均为分析纯;Tris缓冲液和磷酸盐缓冲溶液按文献方法配制;实验用水均为18.2MΩ·cm的超纯水;核酸储备液:称取10mg鱼精脱氧核糖核酸溶于10mL超纯水中,超声5min后制得1mg/mL核酸储备液,置于4℃冰箱内保存。1.2实验方法1.2.1荧光碳点的制备准确称取540mg葡萄糖溶于25mLV(聚乙二醇)∶V(水)=1∶1溶液中,并转移至反应釜中,180℃下反应3h,取出冷却至室温后,再加入450mg己二胺粉末于上述反应液中,于120℃烘箱中恒温反应12h进行钝化,即可得到棕褐色荧光碳点溶液,定容至25mL,该荧光碳点的浓度为0.72mol/L(以碳计)。将制备的碳点溶液用超纯水稀释至0.036mol/L,作为碳点储备液4℃保存备用。1.2.2is缓冲溶液和1.1%的缓冲溶液10.2和10.2工作溶液在5mL比色管中依次加入碳点储备液0.5mL,pH8.8的Tris缓冲溶液0.1mL和适量核酸储备溶液,用水稀释至刻度,摇匀。室温下反应10min后,在荧光分光光度计上于相等的激发波长(λex)和发射波长(λem),狭缝宽度为10nm,进行同步扫描获得RLS光谱。2结果与讨论2.1碳点的吸收光谱图1为合成的荧光碳点的紫外吸收与荧光发射光谱。由图1可知,曲线1为碳点的吸收光谱,碳点在350nm左右出现了明显的特征吸收峰;曲线2为碳点的荧光光谱,在350nm波长激发下,荧光碳点在451nm处得到一个很强的发射峰,这与在紫外灯下荧光碳点发射的明亮青色荧光(3)一致。2.2实验条件的优化2.2.1局部的吸收碳点对体系散射光强度和共振稳定性的影响试验考察了碳点浓度对体系RLS强度的影响。试验结果表明,随着碳点浓度的增大,体系散射光强度迅速增强,但当反应体系中碳点浓度过高时,碳点本身就具有较强的吸收,加入少量核酸,体系的共振光强度仅有较小程度的增强,分析的灵敏度降低。因此,综合考虑,选择碳点溶液浓度为3.6mmol/L。2.2.2trs缓冲液ph的影响试验考察了Tris缓冲溶液(0.15mol/L)和磷酸盐缓冲溶液(0.01mol/L)对体系RLS测定的影响。结果表明,Tris缓冲溶液作为介质时效果较好。进一步探讨了Tris缓冲液的pH对体系共振光强度的影响。分别取pH为5、7、8和10的Tris缓冲液,按1.2.2中方法测定体系的散射光强度,结果如图2所示,体系的散射光强度随着缓冲液pH的升高而逐渐增强,当pH8.0时,体系的散射光强度最强且趋于稳定。为方便配制,本试验选择pH8.8的Tris缓冲溶液,用量为0.1mL。2.2.3散射光强度测定在室温下研究了反应时间对体系RLS强度的影响。结果表明,核酸溶液加入后,体系散射光强度迅速增强,且在10min内反应完全,体系在1h内稳定,故试验选择反应10min后进行测定。2.3共振光散射信号如图3所示,在实验条件下,荧光碳点单独存在时共振光散射信号很弱,但当荧光碳点与核酸相互作用后,则出现了强的共振光散射信号,其最大散射峰位于484nm处,且散射强度随核酸浓度的增加而增加,在一定范围内呈线性关系。这表明在弱碱条件下,两者可能形成了大颗粒复合物。2.4实际样品检测算法测试,其符合以下几种条件实验考察了多种金属离子、糖类、氨基酸等对体系的影响,结果如表1所示,除了极少数干扰物质的容许量相对小外,其他物质的允许量都很大,故本法具有较好的实用性,可直接应用于实际样品的检测。2.5年生小质度检测标准在上述优化实验条件下,当核酸的质量浓度在0.4～30μg/mL范围内时,反应体系的光散射增强信号与核酸的质量浓度呈现良好线性关系。其线性方程为ΔI=5.8311c+8.1469(c为核酸的质量浓度,单位为μg/mL),线性相关系数为0.9964,最低检出限为0.023μg/mL。按“1.2.2