术后制动早期大鼠比目鱼肌纤维形态改变的实验研究

术后制动早期大鼠比目鱼肌纤维形态改变的实验研究

根据临床数据和动物实验，运动减少和刹车会导致明显的骨关节痛变窄。肌梭是骨骼肌内的本体感受器。我们以往的研究发现,在后肢脱负荷条件下肌梭的传入放电活动减少,肌梭功能活动的改变可能是废用性肌萎缩发生发展的重要因素之一。肌梭放电活动是由高位中枢调控下的γ神经元的传出活动引起的梭内肌纤维的收缩活动,牵拉赤道部感觉末梢引起的。因此,梭内肌纤维的结构功能状态直接决定了肌梭功能活动的改变。本研究拟通过电子显微镜技术观察后肢脱负荷早期梭内肌纤维超微结构的变化,旨在揭示模拟失重引起肌梭功能活动改变的可能机制。材料和方法1.实验动物及动物本实验全部采用健康活泼、无呼吸道感染、无运动障碍及无皮肤病的Sprague-Dawley品系的雌性大鼠(西安交通大学医学院实验动物中心提供),体重240~250g,共24只。按随机配对原则分为3组:正常对照组(CON)、后肢制动3d组和后肢制动7d组,每组8只动物。2.动物术后固定采用改良后的Booth和Kelso方法,将动物用水和氯醛(0.4g/kg,腹腔注射)麻醉,在其左侧后肢的踝关节、膝关节及腹股沟等血管容易受压处衬一层薄厚适宜的棉垫,然后用石膏绷带由踝关节向上缠绕至大腿与腹股沟处,将动物后肢固定在静息位。单笼喂养,能够自由活动与进食、进水。室温保持在20℃~25℃,人工控制动物室内照明,每昼夜均保持12h光明与黑暗交替循环。3.肌梭的分离、纯化及固定各实验动物用乌拉坦腹腔麻醉后,先后以生理盐水、1%多聚甲醛-戊二醛固定液灌流大鼠,取出比目鱼肌,置于2.5%多聚甲醛-戊二醛固定液中,4℃过夜。取出固定好的比目鱼肌,在双目解剖显微镜下通过折光性及梭囊辨认肌梭,用分离针完整地分离出单一肌梭。每块比目鱼肌可分离出4~10个肌梭。分离出的单一肌梭浸入2.5%戊二醛固定液4℃冰箱贮存。所有标本经2.5%戊二醛固定后,0.1M磷酸缓冲液浸洗;1%锇酸(OsO4)后固定,乙醇梯度脱水;Epon812环氧树脂浸泡、包埋、聚合;LKB-NOVA超薄切片机切取超薄切片;醋酸铀和枸橼酸铅染色;透射电镜下观察肌梭的超微结构并拍照。高倍镜下梭内肌纤维超微结构的改变1.正常对照组大鼠比目鱼肌肌梭的形态结构图1A为解剖显微镜下分离出的一个完整肌梭。如图1A所示,肌梭中央膨大区称为赤道部(Equatorialu3000region);赤道部两侧为肌梭的极部(Ploaru3000region)。典型的大鼠比目鱼肌肌梭由3~4条梭内肌纤维组成(图1A,1B),包含1条核袋1纤维、1条核袋2纤维和1-2条核链纤维。在横切面,上核袋2纤维直径最粗,其次是核袋1纤维,核链纤维较细小(图1B)。在高倍镜下,细胞核集中分布于梭内肌纤维的赤道部位(图1C),在两极部有类似于梭外肌的横纹样结构(图1D)。2.后肢制动3天后梭内肌纤维超微结构的改变制动3天后,肌梭梭囊连续、完整、较光滑,神经末梢结构无明显改变,核袋、核链纤维结构基本完整,部分肌纤维出现水肿(图2A)。高倍镜下,最明显的改变是胞浆尤其是核周线粒体明显增生肿胀(图2B,2C)。纵断面Z线基本完整,无明显排列紊乱及波浪样改变(图2C)。部分梭内肌纤维核膜局部出现膨出(图2D)。3.后肢制动7天后梭内肌纤维超微结构的改变制动7天后,肌梭梭囊明显迂曲,间质增生,梭内肌纤维直径明显减小,整个肌梭呈固缩状(图3A)。高倍镜下,最明显的改变是细胞核的退行性改变(图3B,3C):核膜迂曲内陷,细胞核变形,核周出现大量的溶酶体样致密物(图3B);部分核袋纤维核区细胞核消失(图3C)。感觉神经末梢也可见溶酶体样物质(图3D)。结构功能状态对肌梭功能的影响如所周知,梭外肌的张力维持是由γ神经元和肌梭形成的γ环路来控制的。在后肢脱负荷的条件下,由于重力作用的消失,梭外肌纤维处于缩短位,肌梭的生理性刺激减少甚至消失。此时肌梭的传入活动则可能主要依赖于高位中枢调控下的γ运动神经元的传出活动引起的梭内肌的收缩。研究资料表明,后肢脱负荷的条件下,大脑皮层运动区、小脑蚓部等部位神经元的活性减弱。这些中枢部位神经元活性的减弱,必将减弱对γ-传出活动的抑制。而后肢脱负荷的条件下,γ-运动神经元的形态结构无明显改变。因此,梭内肌纤维的结构功能状态直接决定了肌梭功能活动的改变,进而影响梭外肌的功能活动。本研究结果表明,后肢脱负荷3天,梭内肌纤维的线粒体结构就发生改变。线粒体是细胞进行有氧氧化的关键部位,线粒体发生代偿性乃至破坏性的改变,必然会影响到细胞的代谢活动。肌梭是一种慢适应牵张感受器,即使在松弛状态下肌梭也有自发的放电活动,这必然需要大量的钠泵活动泵出不断内流入感觉神经末梢内的Na+,以维持细胞的静息膜电位,恢复肌梭的兴奋性。线粒体结构的改变,必然会使Na+-K+-ATP酶的活动受到影响,进而影响肌梭感觉神经末梢的静息膜电位,影响肌梭对外界刺激反应的敏感性。以往的研究资料表明,凋亡机制可能参与了废用条件下梭外肌萎缩的发生和发展。由于肌梭结构的特殊性,至今未看到有关梭内肌纤维凋亡的相关研究。本研究发现,梭内肌纤维在脱负荷早期,梭内肌纤维的细胞核的结构也发生明显的退行性改变,这种改变明显早于、且重于梭外肌纤维的改变。本研究组以往的研究结果发现,后肢脱负荷3天后,大鼠比目鱼肌肌梭内Ca2+荧光强度明显增加,提示游离Ca2+浓度增加。关于这种细胞核的改变、钙超负荷及线粒体改变的关系及其机制还不清楚,还有待于进一步的研究。无论是线粒体结构的改变、