肌酸对骨骼肌废用性萎缩后恢复的影响

肌酸对骨骼肌废用性萎缩后恢复的影响

磷酸肌酸是快速肌肉能量储存的能量库，肌肉酸是合成磷酸肌酸的重要原料。特别对短时间、大强度、间歇性的重复运动具有重要的意义。因此补充肌酸作为营养补剂已在运动训练过程中广泛应用。关于补充肌酸的生物化学作用最早是研究培养的胚胎骨骼肌细胞,发现高浓度的肌酸可能促进肌球蛋白重链的合成,但后来的人体实验对此提出异议。目前仍未见补充肌酸可以直接刺激蛋白质合成的报道。肌酸应用在其他方面也有报道,健康老人每天补充肌酸可以增强肌肉机能。已有大量的实验已证实高剂量补充肌酸可以增加磷酸肌酸储备,这对年龄老化、无活动能力和许多疾病等原因引起的肌肉萎缩和肌肉机能下降也具有重要的意义。有关补充肌酸和抗阻训练能够促进股外侧肌肌肉萎缩后肌肉机能的恢复本课题组已做了研究(待发表)。本文在此基础上进一步研究了健康大学生外固定腿2周使肌肉愈接近废用性萎缩,并在固定期和恢复期10周过程中连续补充肌酸和抗阻训练测定骨骼肌废用性萎缩恢复的组织化学和生物化学的变化,同时测定了骨骼肌表达的生肌调节因子-MyoD、Myogenin和Myf-5的变化,探讨肌酸加速骨骼肌废用性萎缩后恢复的分子机制。1实验方法1.1材料和训练方法实验对象男9人、女9人,身体健康,年龄20～23岁。实验期间受试者不服任何药物。清淡饮食(600千卡,60%碳水化合物,25%脂肪,15%蛋白质),双盲实验12周。所有受试者在实验前测试体重和肌肉活检,活检肌肉取右腿股外侧肌,待组织化学和生物化学分析。之后受试者分为两组,实验组9人,对照组9人。实验组服肌酸水合物,每天四次,每次5g。对照组服与实验组具有颜色和味道相同的安慰剂。实验组和对照组均用聚酯模型将右腿外固定共2周,固定范围从腹股沟到踝骨,膝关节角度在160度左右。固定期间给受试者提供拐杖,允许他们自由活动,固定1周后,卸下固定模型,膝关节活动20分钟后,让受试者洗澡后换上新的聚酯模型,接下来再固定1周。第二周末解除固定后重复实验前测试体重和肌肉活检。固定后进行恢复训练,训练前三天受试者每天接受30分钟的理疗以促进膝关节灵活性的恢复,接下来的连续10周进行右腿恢复训练,每周训练三次。前三周恢复训练的负荷以60%的最大膝屈伸力做右腿膝关节90°曲伸运动,12次为一组,组间隙2分钟,共做4组。后7周训练负荷减至每次膝屈伸运动6次,其他相同。在恢复期的前三周实验组和对照组服肌酸和安慰剂的量减至每天3次每次5g,后7周减至每天一次每次5g。同时分别在第3周和第10周恢复后重复测试体重和肌肉活检。1.2肌肉中atp、cp和游离c应用针刺活检技术采取右腿股外侧肌肉,先在被取肌肉部位注射2～3ml的普鲁卡因局部麻醉,切口透过皮肤和肌肉筋膜。解除固定后,恢复第3周和第10周后的肌肉样本分别取自在右腿外固定前切口的近端或远端。活检肌肉取出后去除血迹和可见的结缔组织迅速放入液态氮中,储存在-80℃待检。为肌肉中的生物化学物质检验的肌肉样本冷冻干燥并用石油洗两次除去脂肪,然后将肌肉样本除去可见的血迹和结缔组织后磨成粉末。取粉末3～5mg,应用分光光度计测定ATP、CP和游离C。肌肉中总的肌酸浓度由CP和游离C浓度之和计算。用-20℃薄片切片机将活检肌肉切成10μm薄片应用肌纤维ATP酶染色法鉴定肌纤维类型。1.3牛血清蛋白和多克隆抗体pa制备肌肉组织细胞核抽提物,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。应用WesternBlotting技术对MyoD、Myogenin和Myf-5进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用电泳法将蛋白质转移到硝酸纤维薄膜上(Pharmaciacompany)。采用牛血清蛋白作为封闭溶液,第一抗体为羊抗兔IgG的辣根过氧化酶(1∶500Bio-RADLaboratories)。MyoD、Myogenin和Myf-5的第二抗体分别为通过亲和纯化的兔多克隆抗体1∶400,M-318;1∶400,M-225和1∶400,C-20(SantaCruzBiotechnology)。应用扫描仪(HewlettPackard,ScanJet4C/T)对所获蛋白质印记扫描,并用图像分析软件(MolecularDynamicsversion4.1,US)对扫描后产生的绿色荧光图像进行密度分析。1.4数据计算所有数据均采用MS-EXCEL统计软件进行处理,数据以平均数±标准差表示,T检验显著性标准为P<0.05。2结果2.1两组体重、麻黄、哈尔滨市实验前对照组和实验组体重分别为66.9±2.7kg和65.9±3.1kg。实验后两组体重均增加(P<0.05),并在训练期间两组之间均无显著差异。固定后即刻和恢复期3及10周后在对照组体重分别为68.2±2.8;68.1±2.8和68.4±3.0kg;而实验组分别为66.7±3.2;67.3±3.2和68.4±3.3kg。在整个实验过程中受试者未见不良反应。2.2、a和b截面积增加的比较,总股外侧肌亚实验前和恢复期不同亚型肌纤维的截面积(图1、图2和图3),实验前Ⅰ、Ⅱa和Ⅱb在各组中没有差异。2周外固定后和三周恢复后实验组和对照组不同亚型肌纤维变化均仍不显著。但10周恢复后与固定后值比较,对照组Ⅰ、Ⅱa和Ⅱb截面积分别增加20%、30%和37%;而实验组各亚型增加的幅度均大于对照组(P<0.05),分别为40%、56%和59%。10周恢复后Ⅰ型肌纤维占总股外侧肌的百分比由实验前的60%下降到53%(对照组)和53%下降为43%(实验组,P<0.05)。而Ⅱa型肌纤维分别增加从28%到34%(对照组)和29%到39%(实验组,P<0.05)。在Ⅱb型肌纤维对照组和实验组分别增加13%和17%。2.3肌肉游离肌酸浓度实验前实验组和对照组CP浓度没有差异(表1)。外固定后对照组CP浓度比较实验前下降约15%,恢复3周后又达到原来的水平,并在后来的恢复期一直保持这一水平。相反,在实验组恢复3周后CP较实验前增加约12%,但在10周恢复后又返回到原来的水平。在实验过程中实验组和对照组肌肉游离肌酸均有相似的变化(表2),在固定和恢复期游离肌酸浓度较实验前均增加(P<0.05)。肌肉总肌酸浓度实验前两组没有差异(表3)。在对照组固定没有改变总的肌酸浓度,而在3周恢复后增加显著(P<0.05)。而在实验组,肌酸总浓度从固定后到恢复3周一直增加,但在恢复后期又返回到实验前水平。肌肉ATP浓度变化从17.5±0.6到21.5±0.5mmol·kg-1D·W,而两组固定和恢复肌肉中ATP浓度均没有影响。2.4实验组和对照组疗效比较实验前后和恢复期MyoD和Myf-5呈相似的变化(图4),两周固定后对照组和实验组均下调(P<0.05),3周恢复到实验前水平,10周后显著上调(P<0.05),而实验组较对照组上调更显著(P<0.05)。Myogenin在整个实验过程中变化均不显著(图5)。3补充肌酸对肌肉cp浓度和肌肉功能的影响本研究提示补充肌酸和抗阻训练有效地提高了股外侧肌各亚型肌纤维的截面积,特别是Ⅱa和Ⅱb增加更显著(P<0.05见图2、3),说明骨骼肌有能力迅速和逆向地改变它的组成,有利于废用萎缩肌肉的结构和功能完整性恢复。有研究证明,人类Ⅰ型和Ⅱ型肌纤维直径具有适应肌肉负荷的变化能力,膝伸张训练能使Ⅰ和Ⅱ型肌纤维肥大。我们的实验结果显示,补充肌酸有利于使废用的萎缩肌肉的恢复时间缩短,并且肌酸的同化作用在快肌和慢收缩肌纤维同时发生,补充肌酸进行10周膝伸张训练后均可使Ⅰ,Ⅱa和Ⅱb型纤维产生肥大(图1、2、3),但Ⅱ型肌纤维增加的更显著。更有意义的是,与对照组比较,补充肌酸和抗阻训练结合比单纯抗阻训练12周使股外侧肌截面积各亚型的截面积均增加,这一发现证明补充肌酸可以引起肌肉肥大。因此,长期患病的病人又无能力运动,补充肌酸可以减缓肌肉萎缩。先前的研究表明,补充肌酸每天20g,连续4～5天可以增加肌肉总肌酸含量,尤其是原来骨骼肌肌酸浓度低者。这是因为肌酸的一部分被磷酸化可以使细胞内的CP浓度增加5%～20%。我们的研究结果发现,补充肌酸可以减少由于固定引起的肌肉CP浓度的下降,由表1可见外固定期间对照组肌肉CP浓度呈现下降趋势,而在实验组没有变化,但两组保持相似的实验过程也可能显示CP浓度在正常的生理范围波动不是关键的问题,而是在一次最大动态训练中产生了肌肉最大峰力矩和输出功率(本实验的前一部分的研究)。本实验结果也发现,固定后肌肉CP浓度比较实验前增加约10%,恢复期的后7周CP浓度又返回到原来的水平,这与前面的研究结果相反,即长期的补充肌酸肌肉CP浓度不变。这种反弹的机制,与肌肉的功能是否有关系还不清楚。有许多研究表明,连续低剂量的肌酸摄入仍然可以保持高水平的CP浓度是由于有前面的肌酸储备。如CP一样,补充肌酸后肌肉游离肌酸浓度在恢复期的7周至10周两者均下降,肌纤维面积明显增加,推测此时肌酸的同化作用加强。由此,我们粗略推断固定后的肌肉恢复到正常的功能至少需要3～4周。Green等1996年报道,补充肌酸同时服用大量的单糖会使骨骼肌肌酸浓度明显升高,这是因为糖可以刺激胰岛素分泌,而胰岛素能够激活肌细胞钠泵及Na+依赖性肌酸转运蛋白,因此加速了肌酸的转运。Seenge等(1998)观察到大剂量糖可使血液胰岛素达到高水平,大于100mU/L,有利于肌酸转运进入肌细胞。由于参加本研究的志愿受试者在固定期间仍能保持日常活动而没有感到受伤的痛苦且固定的时间短,固定可能引起的萎缩程度相当的小,因此对于废用性萎缩的肌肉恢复最适宜的肌酸剂量还需要进一步的研究。MyoD、Myogenin和Myf-5等是惟一在骨骼肌表达的生肌调节因子(MRFs),MyoD和Myf-5在骨骼肌肌肉生成的过程中起重要的作用。Myogenin基因的定向突变引起分化过程的匮乏导致新生的肌细胞仅仅存在肌原纤维和正常单核细胞的成肌细胞。MyoD和Myf-5的功能可能是调节从初期细胞增值过程到细胞有丝分裂期后的成肌细胞,而Myogenin的功能是调节末期的细胞的分化过程。最近的研究报道β-肾上腺素能受体兴奋剂clenbuterol可以改善被固定后的大鼠跖肌肌肉萎缩的程度,增加Myogenin的mRNA表达水平,而MyoD的水平不变。KunihiroSakuma等报道,Myogenin和MyoD的mRNA水平可能具有对特定的肌原纤维类型的蛋白质合成调节起重要的作用。Westernblotting分析在快肌纤维比在慢肌纤维MyoD和Myf-5蛋白水平显著增高,相反在慢肌纤维Myogenin蛋白具有最高的水平。我们的实验结果也显示:补充肌酸和抗阻训练对肌肉废用性萎缩的恢复期MyoD、Myf-5的变化与股外侧肌各亚型的肥大具有一致的结果。但Myogenin在整个实验过程中变化不显著,我们分析这可能是因为恢复期Ⅱ型肌纤维比Ⅰ型肌纤维增粗的幅度更显著。这可能说明肌肉亚型肌纤维增粗与持续的补充肌酸有关,由此我们推测可能伴随着肌肉收缩蛋白和结构蛋白量的增加,这值得进一步研究。4补充肌酸补充肌酸和抗阻训练有