酵母培养物添加水平yc对瘤胃内环境的影响

酵母培养物添加水平yc对瘤胃内环境的影响

yc被广泛应用于反刍动物的日常食品中。最早的报道是,1925年Eckles等将酵母作为泌乳牛的蛋白质补充料,发现能改善其生产性能。20世纪40~50年代,人们发现在反刍动物日粮中添加低剂量YC能提高其日增重及产奶量(李声永等,2002)。目前,酵母培养物在反刍动物瘤胃调控方面得到进一步的应用,其主要研究指标是瘤胃内环境参数,主要包括瘤胃液pH、挥发性脂肪酸浓度及比例、瘤胃液总氮、氨氮、尿素氮和蛋白氮浓度。这些参数能反映与日粮的利用效率关系极为密切的瘤胃发酵模式。本试验用3只装有永久性瘤胃瘘管的绵羊,研究以粗饲料为主的配合日粮中添加不同水平酵母培养物对瘤胃内环境参数的影响。1材料和方法1.1试验时间和地点试验于2003年11月~2004年6月,在甘肃农业大学动物科学技术学院教学实习基地进行。1.2动物和测试前的准备1.3yc添加量试验选用3只术后体况良好的试羊,(编号分别为T1、T2和T3),采用3×3无重复拉丁方设计,设3个处理,即YC添加量0%、1.5%和3%;试验分3期进行,每期试验包括预试期10d,正试期为6d,共16d。具体试验方案见表1。1.4饲料的配方确定基础日粮参照“中国(内蒙古)建议的内蒙古毛用羯羊的营养需要量”的1.3倍维持需要量配制。饲料原料均从市场买进,先用锤片式粉碎机分别将各饲料原料粉碎,分析其营养成分,而后用实测值计算配方(ME用表中列值计算),按表2配方进行配料、混合,然后将混合饲料分别压制成直径5mm、长度为15mm左右的硬颗粒饲料,装袋后备用。试验日粮组成为:(1)基础日粮+0%YC;(2)基础日粮+1.5%YC;(3)基础日粮+3%YC。基础日粮的粗精比为1.5试羊的饲养时间在试验开始的前1个月,对试羊进行驯食,即逐渐转变为给羊喂以符合其营养需要的颗粒饲料,使羊在试验开始时适应于摄食颗粒饲料。在试验期,将试羊置于消化代谢笼中单笼个体饲养。整个试验期,每日每只羊的全混合日粮颗粒料饲喂量约为体重的3.5%(平均0.84kgDM),分别在每日8∶00和17∶00时各等量投喂一次,次日饲喂前称量余料;自由饮水。1.6瘤液中总氮、氨态氮、尿素氮、尿素氮、尿素氮、挥发性脂肪酸含量测定hcgl2在正试期的最后1d,分别在8∶00(饲喂前),9∶00,10∶00,12∶00,14∶00,16∶00各采集瘤胃液50ml,立即测定其pH,然后用4层纱布过滤,收集于玻璃瓶,并按瘤胃液容积的1%加入饱和HgCl2溶液(使酶灭活)后,放入冰箱(-20℃)保存,用于测定瘤胃液中的总氮、氨态氮、尿素氮、蛋白氮和挥发性脂肪酸。1.7样品处理和分析方法1.7.1肿瘤胃ph的测定1.7.2标准曲线的制作(1)试剂的配制:A液:称取0.08g亚硝基铁氰化钠,溶于100ml的14%水杨酸钠溶液(取14g的水杨酸钠,用蒸馏水定容至100ml)。B液:量取2ml的次氯酸钠溶液混于100ml0.3M的NaOH溶液中即成。(2)标准曲线的制作:准确称量0.182g的分析纯氯化铵,用0.2的溶液溶解后定容至100ml作为母液,取10ml母液用蒸馏水稀释至100ml作为工作液,此液含氮量为10mg/dl。依次取工作液0、1、2、3、4、5、6ml置于7个50ml容量瓶,分别加蒸馏水使之总量成为10ml,再用0.2M的HCl定容至刻度(此工作液含NH3-N分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/dl)。分别准确量取各液0.4ml置于10ml试管内,依次加入A液2ml和B液2ml,摇匀静置10min后,以0液为空白用721型分光光度计在波长700nm下用1cm光径的比色皿进行比色。建立吸光度x对NH3-N浓度y的回归方程。本次论文制作的标准曲线为:y为NH3-N浓度,x为吸光度。(3)样品分析:将用4层纱布过滤后的瘤胃液4000r/min离心15min,量取2ml上清液(对氨态氮含量大的样,取1ml或0.5ml,然后用蒸馏水稀释至2ml),置于15ml试管内,再加入8ml0.2M盐酸至10ml,摇匀。移取此液0.4ml置于10ml试管内,按上述制作标准曲线的方法进行比色。样品中NH3-N含量(mg/dl)为:[10ml/取瘤胃液量(ml)]×y(mg/dl)1.7.3肿瘤胃内氮氮的测定瘤胃液尿素氮采用二乙酰一肟比色法(试剂盒由南京建成生物工程所提供)。1.7.4氮mg/dl的计算瘤胃液蛋白氮计算公式如下:瘤胃液蛋白氮(mg/dl)=瘤胃液总氮(mg/dl)-瘤胃液氨氮(mg/dl)-瘤胃液尿素氮(mg/dl)1.8统计分析2试验结果2.1瘤液ph的变化,既是日粮及日粮添加量;从表3可见,饲喂前各处理瘤胃液pH均处于最高水平;饲喂后各处理瘤胃液pH均下降,至饲喂后2h降至最低;之后又逐渐回升,到饲喂后8h仍低于采食前的水平。日粮各处理间各时间点测定值和平均值差异均不显著(P>0.05),但食后4、6、8h时间点,添加1.5%和3%YC日粮瘤胃液pH有较0%添加日粮高的趋势(P=0.334、P=0.380和P=0.219),两处理间pH变化基本一致。瘤胃液pH是一项反映瘤胃发酵水平的综合指标,它受日粮性质、唾液分泌、瘤胃内VFA及其他有机酸的生成、吸收和排出的影响。pH也反映可消化碳水化合物的发酵速率(等,1992),瘤胃液pH的一般变动范围为5.5~7.5,呈现有规律变动,一般于饲喂后2~6h达最低值(韩正康等,1982)。本试验在食后4h之前,添加YC日粮瘤胃液pH均略微高于未添加日粮;在饲喂后6~8h,无论1.5%添加日粮还是3%添加日粮,瘤胃液pH均比未添加日粮高出约0.2,但统计结果差异并不显著。这与Williams等(1991)的试验结果基本一致。可能是添加的YC刺激了乙酸利用菌的活性,降低了瘤胃中乙酸的浓度,从而使瘤胃液pH升高。本试验各处理瘤胃液pH变化幅度较缓,有利于瘤胃微生物的发酵,从而提高了有机物质的消化率。1.5%和3%YC添加日粮有机物消化率均高于0%添加日粮,也可能与添加YC提高了瘤胃液pH的稳定性有关。2.2瘤液总氮浓度从表4可见,除个别时间点外,各处理瘤胃液总氮浓度均为先上升后迅速下降,至食后8h降至最低。各处理间各时间段瘤胃液总氮浓度测平均值的差异均不显著(P>0.05);不同处理间各时间点测定值高低错落,但平均值很接近。添加3%YC日粮瘤胃液总氮浓度呈现较0%添加日粮低的趋势。2.3日粮氨氮浓度变化从表5可见,各处理瘤胃液氨氮浓度变化规律基本一致,在采食前均处于较高水平,采食后逐渐下降,至食后8回升。3%YC添加日粮氨氮浓度与其他两添加水平相比下降较为缓慢;1.5%和3%YC添加日粮在食后6h降至最低,之后又逐渐上升。各处理各个时段测定值及平均值的差异均不显著(P>0.05),但3%添加日粮在采食后1和2h,瘤胃液氨氮浓度较其他两日粮有较高的趋势(P=0.081和P=0.270);1.5%添加日粮在采食后8h呈较高趋势(P=0.171)。2.4yc添加日粮在食后6h内的下降从表6可见,各处理瘤胃液尿素氮浓度总体趋势是先降低后升高,但0%添加日粮在食后2h内降低,之后上升,至食后6h又下降,并出现峰值;1.5%和3%YC添加日粮在食后4h内下降至最低,之后逐渐上升,3%YC添加日粮至食后8h,仍有上升趋势。各处理间各时间段瘤胃液尿素氮浓度测定值与平均值差异均不显著(P>0.05),但3%添加日粮在采食后各时间点均有低于其他两处理的趋势。2.5瘤液蛋白总氮浓度从表7可见,0%和1.5%YC添加日粮的瘤胃液蛋白氮浓度变化趋势基本一致,即采食后逐渐上升,食后1h出现一峰值,之后缓慢下降,至食后8h降至最低(分别为115.84和75.74mg/dl)。3%添加日粮在采食后上升,之后呈现波浪式变化,即在食后4h又略有上升,而后呈下降趋势,至食后8h亦降至最低(77.50mg/dl)。采食前,1.5%和3%添加日粮瘤胃液蛋白氮浓度有较0%添加日粮高的趋势(=0.217);在食后8h,0%YC添加日粮瘤胃液蛋白氮浓度显著高于两YC添加日粮(P=0.031),在食后6h其测定值也呈现出高于两添加YC日粮的趋势(P=0.129),各处理其余各个时段测定值及平均值差异均不显著(P>0.05)。3讨论3.1食食过程中瘤液总氮的变化瘤胃液总氮包括氨氮、尿素氮、菌体蛋白氮、饲料中可溶解蛋白氮及唾液蛋白氮等。饲料蛋白质含量及降解率对其有直接影响,也与日粮在瘤胃中滞留时间的长短有密切关系。本试验中,各处理瘤胃液总氮在食后1h内均有不同程度的升高,这可能因采食后日粮中快速降解蛋白质部分迅速溶解与降解之故。因试验用日粮经粉碎后压制成颗粒,采食后,其中可溶性蛋白质释放出来或被降解,致使各处理总氮浓度上升。因绵羊采食时间短、反刍次数少,唾液蛋白氮对瘤胃液总氮的贡献可能较小。在采食后1~4h内,瘤胃液总氮浓度迅速下降,原因可能是瘤胃内容物液相流入下消化道的速率较固相快,其间绵羊不断饮水,使瘤胃液浓度不断稀释,从而表现出总氮浓度下降;食后4~8h,瘤胃液总氮浓度下降速度趋于缓慢,可能因此时饲料中滞留的是慢速降解蛋白质和不可降解蛋白质之故。从表4可知,各处理间绵羊瘤胃液总氮浓度差异不显著,表明添加YC对绵羊瘤胃中日粮氮的降解、微生物利用效率及氮的流出速率等没有显著影响。3.2日粮中瘤液氨氮浓度的变化作为瘤胃内环境的重要指标,瘤胃液氨氮水平反映了日粮蛋白质含量、日粮蛋白质在瘤胃内降解的特性、能量供应和微生物蛋白质的合成状况。瘤胃液氨氮既是日粮中蛋白质、内源性蛋白质和非蛋白氮分解的终产物,同时也是在有能量和碳链的情况下,瘤胃微生物合成菌体蛋白质的主要氮源。日粮中蛋白质浓度对瘤胃液氨氮浓度具有极为重要的影响。当日粮中蛋白质含量不足或蛋白质难以降解时,瘤胃液氨氮浓度很低(<5mg/dl),此时瘤胃微生物生长缓慢,碳水化合物的分解利用也受阻(杨凤等,2000)。瘤胃液氨氮的最适浓度范围较宽(8.5~30mg/dl),也有报道认为在10~50mg/dl范围内较为合适,这与瘤胃内微生物种群、能量和碳架的供给有关。Satter等(1981)认为,氨氮浓度在5mg/dl以上,已足以满足微生物生长和微生物蛋白质的合成。本试验各处理日粮在采食后瘤胃液氨氮浓度变化于17.19~36.09mg/dl范围内,处于文献报道中的最佳浓度范围之内。虽然日粮中粗蛋白质水平较低(CP9.98%),但因粉碎、制粒等加工过程可使蛋白质降解速率有所提高,从而使氨氮浓度处于一个较合适水平。本试验各处理日粮均在食后1~6h内氨氮浓度下降,但并未形成氨峰,这可能是日粮粗蛋白质含量与有效能量匹配合适,降解生成的氨被微生物迅速利用,不在瘤胃内积累,从而提高了氨氮的利用率,因而瘤胃液氨氮总体上呈现下降趋势。采食6h后,各处理瘤胃液氨氮均有不同程度的提高,尤以1.5%添加日粮提高的幅度最大,3%添加日粮次之,0%添加日粮最低,可能是在采食6h以后,瘤胃内速效能源耗空,微生物对氨氮利用效率下降,因而氨氮浓度逐渐上升。从表5及以上分析可知,虽然添加YC不同水平日粮的瘤胃液氨氮浓度动态变化不完全一致,但各处理的平均值相近。表明在本试验条件下,添加YC对瘤胃液氨氮浓度无显著影响。3.3瘤液尿素氮浓度瘤胃内容物中尿素酶活性很高,其水解尿素的速率是微生物利用氨速率的4倍;瘤胃上皮细胞内的尿素酶能把从血液中扩散到瘤胃粘膜的尿素水解为氨,生成的氨迅速扩散,通过上皮细胞进入瘤胃;在瘤胃内pH条件下,氨转化为离子态,从而被保留在瘤胃内。所以瘤胃液中尿素氮的浓度保持在一个较低水平。本试验各处理尿素氮浓度差异并不显著,其浓度在1.16~4.19mg/dl范围内,是一个较低水平。这主要是日粮中尿素氮浓度本来较低,另一方面可能与采食颗粒饲料所用时间短、反刍次数少,吞咽的唾液量少,进入瘤胃的再循环尿素量相应小有关。另外,还可能与限量饲喂及饲喂时间间隔较长有一定关系,关于这一推测,尚待进一步研究证实。本试验瘤胃液尿素氮浓度动态变化的总体趋势是采食后先降低后升高,但0%添加日粮在食后2内降低,之后上升,食后6h开始又下降;1.5%和3%YC添加日粮在食后4h内下降至最低,之后逐渐上升;至食后8h,3%YC添加日粮仍有上升趋势,但在各时间点上始终低于1.5%和0%YC添加日粮。有研究结果表明,较低的尿素氮水平有利于氮的利用,过高会导致血浆及尿中尿素氮升高而造成氮的浪费。总之,在本试验条件下,添加YC对绵羊瘤胃液尿素氮影响不显著(P>0.05)。3.4日粮对反充食肉微生物的影响瘤胃液蛋白氮包括饲料可降解蛋白氮和微生物蛋白氮,在一定程度上可反映微生物蛋白合成状况。本试验各处理瘤胃液蛋白氮均在食后1h上升,可能与经粉碎、制粒后日粮蛋白中可溶部分快速降解有一定关系;也与微生物蛋白质合成不无关