冬虫夏草对制动大鼠肌结的影响

冬虫夏草对制动大鼠肌结的影响

骨骨骼的明显收缩是由舍音系统的结构、收缩的蛋白表面、物质能量代谢和酶学特征引起的。上述变化会暂时甚至长期影响到运动技能水平的发挥和运动寿命的拓展,所以制定科学合理的肌萎缩防护措施是运动医学和康复医学领域的重要课题。肌梭传入中枢的冲动减少进而诱发有关中枢部位发生改变是废用性肌萎缩发生和发展的始发原因。因而可以设想:筛选药物维持或提高肌梭的兴奋性,是抗衡肌肉萎缩的一种可行途径。我们以前的研究证明,萃取冬虫夏草(CS)的有效成分对蟾蜍离体单一肌梭具有正向刺激作用,但从整体及在体层面上CS对废用性肌萎缩是否具有对抗作用未作报道。本研究对大鼠实施后肢制动,检测比目鱼肌(SOL)梭内、外肌纤维肌球蛋白重链(MHC)的表达,观察不同浓度CS对其形态与梭外肌纤维构成比的影响,持续地从机体在体层面探讨CS对废用性肌萎缩的防治作用和对抗机制。1材料和方法1.1cs提取液质量浓度的测定SD品系大鼠由西安交通大学医学院实验动物中心提供(健康雌性),体重220～250g。药品:CS(西安市药材总公司),将原药烘干磨碎,取干粉100g,加蒸馏水100mL,置56℃水浴箱1h,悬液经2000r/min离心15min,取上清液经0.45μm混合纤维素酯膜滤器过滤除菌,提取物pH为6.4,得到质量浓度为1g/mL(按原生药计)样品液,置4℃冰箱存放备用。用任氏液调节CS提取液pH值为7.4。每天按2.5、5、7.5g/kg三种质量浓度分别灌胃1次。动物分为5组,每组8只,遵循《关于善待实验动物的指导性意见》:正常同步对照组(CON)、制动(IMM)14d组、制动+2.5g/kgCS(IMM+2.5g/kgCS)14d组、制动+5g/kgCS(IMM+5g/kgCS)14d组、制动+7.5g/kgCS(IMM+7.5g/kgCS)14d组。1.2石膏内固定组采用经典制动模型且加以改良:对制动大鼠行麻醉术(乌拉坦1.5g/kg腹腔注射),选择右侧后肢,在其易受压关节处衬垫软层(保护其血管与神经的正常功能和代谢),应用石膏绷带环绕固定大鼠的踝膝关节(膝关节伸展约180°,踝关节背伸约45°),使SOL最终处于伸长位(14d)。1.3高效石蜡切片对各组大鼠行麻醉术(乌拉坦1.5g/kg腹腔注射),称量体重,应用40g/L多聚甲醛经升主动脉进行灌流固定,手术取其右后肢SOL并称重(MWW/BW,以100g体质量标化计算比目鱼肌湿重与体重的比值),在多聚甲醛固定液中浸置过夜(保持温度4℃),固定后进行常规石蜡垂直位包埋,作石蜡切片时优选SOL肌腹的横截组织,以5μm作为切片厚度标准,染色过程遵循传统的ABC法,抗快缩型MHC抗体一抗为MY-32,二抗为抗小鼠IgG,产品分别由Sigma公司和Vector公司提供。1.4肌纤维细胞数与横截面积的系统计算对各组大鼠Ⅰ型肌纤维和Ⅱ型肌纤维的构成进行定量计算,每张随机抽取的切片采用Image-ProPLUS图象分析系统进行肌纤维细胞数与横截面积的计量。应用单因素方差分析法(ANOVA,SPSS10.0)对实验数据进行统计分析,定量资料以均数±标准差表示,P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1废用状态间慢肌纤维超微结构的变化大鼠SOL梭外肌纤维在废用14d后变化明显:IMM组快缩型MHC表达有增强趋向,其Ⅱ型肌纤维(快肌)的构成比由13.56%增至29.67%(表1),其Ⅰ型肌纤维(慢肌)的构成比由86.44%降至70.33%,而且两类肌纤维的平均横截面积(CSA)和MWW/BW的数值明显减小(P<0.05)。结果证实,废用状态下慢肌纤维呈现向快肌纤维转变的趋向。废用大鼠SOL梭外肌纤维的显微结构显示,肌束界限不清晰,结缔组织面积构成增加,肌纤维胞内结构松散,肌膜曲折而不平滑,肌纤维呈三角形或多边形。服药组大鼠在废用状态下与制动对照组的染色结果比较显示,慢肌纤维所占比率较高,快肌纤维的比率较低(P<0.05),服药组中以IMM+7.5g/kgCS组的效果更为显明;服药组各类肌纤维CSA和MWW/BW数值低于正常对照组,但无统计学意义(P>0.05)。服药组梭外肌超微结构改变均为明显减轻:肌膜较为完整,肌原纤维边界清晰,粗细肌丝排列规律,Z线比较整齐,细胞核核膜完整,形态结构接近正常。研究结果证实,废用状态下大鼠服用CS对梭外慢肌纤维向快肌纤维的转化过程具有对抗作用,而且其对抗作用具有一定的药物剂量依赖关系。2.2废用肌梭结构变化正常状态下SOL梭内肌纤维的染色结果显示(图1A),其核袋Ⅱ纤维大部分呈现阴性特征(没有着色),另有小部分呈现弱阳性特征(有浅黄色沉淀),核袋Ⅰ纤维完全呈现阴性特征(没有着色),肌梭的核链纤维则呈现明显的阳性特征(棕褐色沉淀)。正常的肌梭结构显示,肌梭被囊平滑,梭内肌的肌原纤维边界清晰,轴周之间分列有序。废用后SOL梭内肌纤维的染色结果显示(图1B),其核袋Ⅱ纤维呈现阳性表达增强的特征(黄色沉淀),其核袋Ⅰ纤维仍旧呈现阴性特征(没有着色),肌梭的核链纤维则呈现出强阳性的表现(深褐色沉淀)。染色结果证实,废用状态下梭内肌纤维也出现了由慢肌向快肌转变的趋向。废用后的肌梭结构显示,部分肌膜溶解消失,Z线排列明显紊乱,肌原纤维溶解中断,胶原纤维大量增生,轴周间隙层次结构不清,神经末梢也开始变性。服药组肌梭结构基本接近正常(图1C),线粒体轻微肿胀、增生,纤维结构虽有些疏松、水肿,但Z线排列整齐,肌原纤维结构完整。研究结果证实,废用状态下大鼠服用CS对梭内慢肌纤维向快肌纤维的转化过程具有对抗作用。3废用条件下肌梭超微结构的变化众所周知,MHC是肌球蛋白分子中的重要结构,而肌球蛋白又是粗肌丝的主要构成成分,参与肌肉的收缩和舒张过程,其表型的变化必然会影响肌纤维的代谢和功能特性。正常状态下慢肌的MHC主要为Ⅰ型,快肌的MHC主要为Ⅱ型,废用状态下,MHCⅠ型向MHCⅡa型转变,同时伴随氧化代谢酶活性的降低。电泳和组织化学方法测定表明,在废用状态下,快肌中肌球蛋白轻链(MLC)含量增加,而在慢肌的MLC含量减少。因此,认为收缩蛋白轻链和重链表达的改变引起了肌肉收缩蛋白质和量的变化,导致肌纤维类型的转变。本研究结果与前期的资料是一致的:大鼠后肢制动14d后,IMM组SOL梭外肌纤维快缩型MHC表达有增强趋向,其Ⅱ型肌纤维的构成比有所上升,Ⅰ型肌纤维的构成比有所下降,证实废用状态下慢肌纤维呈现向快肌纤维的转变趋向。肌梭是骨骼肌内的一种特殊感受装置,主要感受骨骼肌的长度、张力、运动方向、运动速度及速度变化率。肌梭不断地向中枢传入冲动,一方面产生相应的本体感觉,另一方面反射地产生和维持肌紧张,并参与对随意运动的精细调节。我们以往的研究表明,废用状态下肌梭的放电明显减少;肌梭超微结构的改变早于、重于梭外肌超微结构的改变,并且其改变程度随废用时间的延长而加重;梭内肌反映蛋白质分解状况的泛素表达明显加强,与肌梭传入冲动有关的中枢部位也出现明显的形态学变化。本研究结果显示,废用后SOL肌梭的核袋Ⅱ纤维MHC的表达呈现阳性增强的特征,其核袋Ⅰ纤维仍旧呈现阴性特征,肌梭的核链纤维则呈现出强阳性的表现。染色结果证实,废用状态下梭内肌纤维也出现了由慢肌向快肌转变的趋向。CS提取液的药理成分较为复杂,主要含核苷类、氨基酸多肽、虫草多糖、甾醇糖醇和不饱和脂肪酸元素等,具有抗氧化、抗炎、抑制肿瘤以及增强机体免疫功能等作用。本研究结果显示,服药组大鼠与正常对照组相比较,慢肌纤维所占比率数值较高(P<0.05),快肌纤维的比率数值较低(P<0.05),服药组梭外肌超微结构改变均为明显减轻。研究结果证实,废用状态下大鼠服用CS对梭外慢肌纤维向快肌纤维的转化过程具有对抗作用,而且其对抗作用具有一定的药物剂量依赖关系。推测其可能机制为:①CS的抗氧化应激功效对肌梭的细胞膜具有保护作用。CS提取液中虫草素对超氧阴离子自由基具有较强的特异性清除作用,而CS中含有的D-甘露醇则是羟自由基的特异性清除剂,它们可以通过减少机体自由基的生成而降低对细胞膜的攻击,保护膜功能的稳定性;还可通过增强肌梭细胞内抗氧化系统而展现其抗氧化作用;另外,CS中黏多糖与细胞相互作用,在肌梭的细胞膜表面形成了一层糖屏障,可以阻抗细胞膜脂质流动性的降低,从而保护细胞膜上Na+K+-ATP酶的活性,最终发挥其对肌梭传入放电的维持效应。②CS具有明显促进机体代谢、调节内分