骨骼肌萎缩的发病机制及治疗

骨骼肌萎缩的发病机制及治疗

长期睡眠、神经外露和中长期空间飞行会导致骨骨骼肌肉显著萎缩，尤其是肌肉痉挛，并伴有缓慢肌纤维向快速肌纤维类型转变的过程，肌肉收缩速度加快，易疲劳，胰岛素抵抗等。由于蛋白质占肌肉重量80%以上,所以蛋白质合成的减少和降解的增加是导致骨骼肌发生萎缩的重要原因。关于废用性肌萎缩发生时的形态学改变已研究得比较透彻,随着分子生物学技术的迅猛发展,对于废用性肌萎缩的研究重点已由生理层面转向分子机制的研究。2001年发现了两种在肌肉内特异表达的泛素连接酶:Atrogin1/MAFbx(muscleatrophyF-box)和MuRF1(muscleringfinger1),在十余种肌萎缩发生的早期表达急剧增加,目前已经将Atrogin1/MAFbx和MuRF1作为检测肌萎缩发生的早期生物标记物,二者的发现同时也为肌萎缩分子机制的研究提供了靶点。本文主要对参与废用性肌萎缩的信号通路及上游信号通路与下游靶基因Atrogin1/MAFbx和MuRF1的调控机制做简要介绍。一、转录抑制因子NF-κB首先从B淋巴细胞核抽提物中检出,能与多种细胞基因的启动子和增强子序列位点发生特异结合,促进基因转录与蛋白表达,参与众多与免疫、炎症和应激反应有关的基因调控,同时也参与细胞增殖和凋亡调控等过程。在哺乳动物细胞中NF-κB家族成员共五个:RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p50)、NF-κB(p52)。这些蛋白共同含有一个由大约300个氨基酸组成的氨基末端,称为Rel(relhomologydomain,RHD)同源区,内含DNA结合位点和二聚体化区域以及抑制蛋白IκB结合位点NLS(nucleartranslocationsignal)。根据结构、功能和合成方式可将Rel蛋白分为两组:NF-κB1(p50)和NF-κB(p52)为一组,分别由其蛋白前体p100和p105裂解而来,与家族其它成员形成二聚体存留于胞浆。另一组包括RelA(p65)、RelB和c-Rel,它们没有前体,除含有RHD外,还有一个或多个转录活性区。这两组蛋白成员间可形成同源或异源二聚体。大多数Rel蛋白是转录激活的复合体,但p50同源二聚体和p52同源二聚体是转录抑制的复合体。最常见的二聚体是p50-p65异源二聚体,也就是常说的NF-κB。IκB是NF-κB的阻遏蛋白,可掩蔽NF-κB的核定位信号。在静息状态下,NF-κB与IκB组成异源多聚体(p50-p65-IκBα或p50-p65-IκBβ),以无活性的潜在状态存在于细胞质中。当受到NF-κB激活剂的刺激时,胞浆中NF-κB三聚体复合物中IκB的N端调节区Ser32/36磷酸化,随后该区赖氨酸残基发生泛素化,在蛋白酶小体作用下裂解,从三聚体中解离出来,暴露出p50亚基的易位信号和p65亚基的DNA结合位点,从而使p50-p65异二聚体表现出NF-κB活性,活化的NF-κB从胞浆易位至胞核,与κB序列结合,发挥转录调控作用。在恶病质的病人体内,许多细胞因子尤其是TNF-α的水平升高,通过激活NF-κB进而引起严重的肌萎缩。在体外培养的C2C12细胞中,TNF-α也通过激活NF-κB而抑制肌细胞的分化。在失重或模拟失重的条件下,NF-κB通路同样也被激活,但激活途径与TNF-α激活NF-κB通路的途径不同。在大鼠比目鱼肌内注入NF-κB依赖的报告质粒后进行后肢悬吊,7天后其内荧光素酶的活性是地面对照组的8倍,激活因子蛋白(activatorprotein-1,AP-1)和激活T细胞核因子(nucleurfactorofactivatedTcells,NFAT)依赖的报告质粒的表达没有明显改变,p65的表达也未升高,而p50和Bcl-3(IκB的一种)显著增加。对基因敲除了p50的小鼠后肢悬吊10天后,其肌萎缩程度较野生型要轻。在该小鼠比目鱼肌内注入NF-κB依赖的报告质粒后,后肢悬吊并未引起荧光素酶表达的改变,而同样处理的野生型小鼠悬吊后荧光素酶的活性增加了7倍,基因敲除Bcl-3得到了类似的结果。敲除了p50和Bcl-3的小鼠,不仅能有效对抗模拟失重性肌萎缩,同时也抑制了模拟失重时慢肌纤维向快肌纤维类型的转变,从而提示p50和Bcl-3是诱导模拟失重性肌萎缩必需的转录因子。Cai等研究者在2004年通过两种转基因小鼠MIKK(即肌肉特异IKKβ表达,激活NF-κB)和MI-SR(即肌肉特异IκBα超抑制子表达,抑制NF-κB)进一步证明了NF-κB通路在诱导性肌萎缩过程中的重要作用。在MIKK小鼠中发生了严重的肌萎缩,而在MISR小鼠中则没有发生明显的表型改变,证明内源性激活NF-κB通路足以导致明显的肌萎缩。而且在MIKK小鼠中,MuRF1的表达增加,MAFbx的表达没有改变。将MIKK小鼠与MuRF1-/-小鼠交配生出的MIKK×MuRF-/-小鼠,肌肉萎缩程度介于野生型小鼠与MIKK小鼠之间,说明NF-κB激活引起的肌萎缩至少部分是通过上调MuRF1引起的。在大鼠比目鱼肌中显性负相表达IKKβ可显著抑制尾吊7天后NF-κB的活性,过表达显性负相的IKKβ-EGFP融合蛋白可使尾悬吊7天后大鼠比目鱼肌肌纤维萎缩程度减轻50%,而过表达构成性激活的IKKβ-EGFP可激活NF-κB的活性并诱导肌纤维的萎缩。小鼠骨骼肌中敲除IKKβ不仅可以增加小鼠的肌力及损伤后的再生能力,而且可对抗去神经诱导的肌纤维萎缩、肌纤维类型的转换和肌力的减退。因此,IKKβ/NF-κB/MuRF1信号通路的激活不仅足以诱导肌肉的萎缩,大量的证据也提示该通路在废用性肌萎缩的发生过程中处于核心地位。二、igf-1/pi3k/akt激活的信号转导作用许多生长因子(如胰岛素,IGF-1)和激素都通过激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路调节细胞的增殖、凋亡和分化。PI3K被激活后在细胞膜上生成PIP3,然后以它作为第二信使激活下游的蛋白AKT,活化的AKT直接磷酸化多种转录因子,通过调控转录因子而抑制凋亡基因的表达和增强抗凋亡基因的表达,最终促进细胞存活。前者的一个典型例子是转录因子Forkhead家族蛋白,它的三个成员FKHR、FKHRL1和AFX都含有保守的AKT磷酸化序列。当AKT没有被激活时,Forkhead蛋白通常位于核内,促进凋亡基因的转录;当不同生长因子刺激细胞并激活AKT后,AKT入核磷酸化FKHRL1,后者被转运出细胞核,从而失去了对靶基因转录功能的调控。IGF-1/PI3K/AKT是导致肌肉肥大的主要通路,虽然肌肉萎缩的发生并不简单的是肌肉肥大的反向过程,它们各自有不同的一组基因分别在肌肉肥大和萎缩过程中发挥作用,在信号转导机制方面也截然不同。但新近几年的研究表明两者的发生也有一定程度上的交叉,IGF-1/PI3K/AKT的激活不仅可以导致肌肉的肥大,还可以有效的抑制肌萎缩发生的信号通路。胰岛素样生长因子结合蛋白5(insulin-likegrowthfactorbindingprotein5,Igfbp5)和IGF-1结合而抑制其作用,在大鼠后肢悬吊第1天和第7天Igfbp5的表达分别升高了4倍和7倍。大鼠后肢悬吊14天后,磷酸化及总的AKT的表达水平均下降,AKT下游的转录因子mTOR和p70S6的表达水平在悬吊后同样也呈下降趋势。尽管MuRF1和Atrogin1/MAFbx由不同的机制激活,但IGF-1却通过激活AKT抑制MuRF1和Atrogin1/MAFbx的转录。激活的AKT从细胞膜转移到细胞核并磷酸化转录因子(FOXO),磷酸化的FOXO被转运出细胞核后失去了对靶基因的调控。当肌萎缩发生时,PI3K/AKT通路受到抑制,FOXO去磷酸化重新回到细胞核内,促进MuRF1、Atrogin1/MAFbx以及一些促凋亡基因的转录。FOXO3的激活可引起明显的肌萎缩,过表达FOXO1的转基因小鼠也发生了明显的肌萎缩,同时观察到编码慢肌纤维基因的表达也受到了明显的抑制。糖皮质激素通过促进蛋白质的降解,抑制蛋白质的合成而导致肌肉萎缩。在体外地塞米松也可以诱导肌管发生萎缩,并伴随MuRF1及Atrogin1/MAFbx表达的增加。糖皮质激素可能是通过PI3K/AKT起作用的,因为IGF-1可以对抗糖皮质激素的作用。在模拟失重引起的肌萎缩中,糖皮质激素的水平是升高的,因此糖皮质激素似乎是触发肌肉萎缩的重要因素。但对切除了肾上腺的大鼠进行后肢悬吊,无论是否应用皮质醇都发生了肌萎缩,对正常大鼠悬吊时,即使应用了糖皮质激素的抑制剂RU-38486也未能抑制肌萎缩的发生,证明糖皮质激素表达的增加可能并不是诱导失重性肌萎缩发生的必要因素。三、软件调度与肌肉缩定相关的基因敲除对肌肉的影响TGF-β/Smad通路由转化生长因子β(transforminggrowthfactor-β,TGF-β)、TGF-β受体(transforminggrowthfactor-receptor,TβR)及受体底物Smad蛋白家族信号分子组成。该通路通过调节细胞的增殖、分化、黏附、移行及凋亡而在生物整体及各种器官的发育过程中起重要的作用。当配体(TGF-β家族成员)与TGF-β受体结合后形成受体复合物,激活Smad蛋白,将信号转导至细胞核,调控转录因子的活性。关于TGF-β/Smad通路在骨骼肌生长发育中的作用研究非常多,最先引起人们研究兴趣的是myostatin,该因子是TGF-β家族的一员,对肌肉的生长有很强的抑制作用。myostatin基因编码序列的自然突变可造成比利时兰牛(Belgianblue)和皮尔蒙特牛(Piedmontese)的双肌臀现象,对myostatin基因敲除小鼠的研究表明,突变小鼠的体重比野生型小鼠体重增加约30%,在绵羊和狗体内myostatin的基因变异也会导致肌肉肥大现象。人体中myostatin基因丢失或功能变异会诱导肌肉重量增加,阻断myostatin通路同样会促进肌肉的生长。卵泡抑素(follistatin)是myostatin和其它TGF-β成员的抑制剂,卵泡抑素过表达促进肌肉重量显著增加,并且卵泡抑素过表达的骨骼肌比myostatin基因敲除得到的骨骼肌更强壮。相反,过表达myostatin会引起雄性小鼠骨骼肌肌肉的萎缩,电穿孔法实验进一步验证,在成年鼠中过表达myostatin引起肌肉萎缩的程度与转基因鼠中相似。空间飞行17天后,大鼠腓肠肌、胫前肌、股二头肌和股四头肌内myostatinmRNA的表达均较地面对照组成倍增加,尾悬吊10天后大鼠跖肌内myostatinmRNA表达也较对照增加至110%,蛋白表达增加37%;其受体ActivinⅡB在后肢悬吊第1天表达即增加2倍,在第7天和第14天又分别增加了4倍和4.8倍,ActivinⅡB的上调可能增强了肌肉对myostatin的敏感性,从而抑制了肌肉的生长。虽然靶向敲除myostatin的小鼠并不能对抗尾悬吊诱导的肌萎缩,但新近的研究表明,myostatin诱导肌肉萎缩就是通过其受体ActivinⅡB及下游转录因子Smad2/3来起作用的;通过显性负向表达ActivinⅡB或RNAi干涉Smad2/3而阻断myostatin信号通路后可诱导肌纤维的肥大,并部分对抗去神经或饥饿诱导的肌萎缩。其它TGF-β/Smad信号通路成员如TGF-β1、TGF-β3、TβR1以及磷酸化Smad3在尾悬吊或去神经诱导的肌萎缩中均呈现不同程度的表达增加,因此TGF-β/Smad信号通路在失重性肌萎缩的作用正逐步引起人们的关注。四、模拟失重大鼠nf-b及生物活性化合物诱导的atromin-1和mafbx的活性在肌萎缩过程中活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)的作用越来越引起人们的重视。模拟失重会导致CuZn-SOD的升高,同时过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶及Mn-SOD表达的降低,从而导致ROS的增加。H2O2的增加会促进蛋白质的降解,在大鼠比目鱼肌中过表达过氧化氢酶后可以显著抑制模拟失重7天后NF-κB及FOXO的活化。因此,在模拟失重时骨骼肌内H2O2的增加可能通过诱导NF-κB及FOXO的激活促进了Atrogin-1的表达,导致肌肉蛋白质在泛素依赖的蛋白酶体途径下降解增加。在体外培养的肌管中加入TNF-α后,Atrogin-1的表达被上调,p38、ERK1/2及JNK通路均被激活,应用ERK的阻断剂PD98059及JNK的阻断剂SP600125后均不影响TNF-α诱导的Atrogin-1/MAFbx的激活,而用p38的阻断剂SB203580后