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文档简介

乳酸脱氢酶(LDH)同工酶

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离法掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和流程；验证同工酶理论；了解圆盘凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶的方法。

一、实验目的1.聚丙烯酰胺凝胶的制备和作用

二、基本原理(1)凝胶制备（主要试剂）：丙烯酰胺单体：可聚合成长的直链

粉剂有毒，液体无毒甲叉双丙烯酰胺：为交联剂过硫酸铵：催化剂四甲基乙二胺(TEMED)：加速剂

（最后加，并决定凝胶形成的速度）在催化剂作用下，丙烯酰胺单体聚合成长链，并通过甲叉双丙烯酰胺交联构成三维网状结构的凝胶；网状孔径大小主要由丙烯酰胺浓度决定；一般是7.5%

浓度↑→孔径↑(2)凝胶电泳原理：①电荷效应：凝胶网孔对样品颗粒移动有阻力；阻力大小取决于孔径与样品分子量之比分子量越小，阻力越小，移动越快。调pH→偏离蛋白质的pI→蛋白质带电荷带电荷蛋白质在均匀电场中移动②分子筛效应：2.乳酸脱氢酶同工酶的分离一组同工酶之间的分子结构不同

↓pI、分子量不同↓电荷效应、分子筛效应不同分子量越小、带电荷越多，移动越快人体乳酸脱氢酶同工酶移动速率：

LDH1>LDH2>LDH3>LDH4>LDH52.显色原理LDH催化的酶促反应；PMS：吩嗪二甲酯硫酸盐NBT：氯化硝基四氮唑蓝通过电泳后的显色反应，能验证同工酶的概念（为什么？）

三、操作步骤封口：用带玻璃珠的胶管套在玻璃管的下端；用小烧杯配制凝胶液：P129（TEMED：加1滴，最后加，加后立即混匀灌注，不能出现凝固）灌注：P129。注入距玻璃管上端2cm处。（不能灌满；一杯可灌2个柱）待凝固后拔掉下端封口胶管

（水与凝胶界面出现折光分界线，即凝固）1.凝胶柱的制备将凝胶璃管插入上电泳槽底板孔中；上电泳槽底板插满胶璃管后倒入少量电泳缓冲液，检查有无渗漏(不能有渗漏)

上电泳槽倒入电泳缓冲液，要淹没所有玻璃管上端，以及电极丝；下电泳槽倒入电泳缓冲液，要淹没电极丝；将上电泳槽按放到下电泳槽上，检查玻璃管下端有无气泡(若有，要用水吹掉)2.安装电泳槽血清样品液含溴酚蓝：电泳指示剂蔗糖：增加样品液比重取50ul样品液，加入凝胶玻璃管上端；

3.加样4.电泳电压250V，时间60min；（电泳温度不能过高，否则酶变性）待溴酚蓝移动接近玻璃管下端出口时，断电；

P129（要避免凝胶条断裂）5.剥胶6.显色电泳结束前10min配制显色液：P129（配好后避光，PMS临染色前再加）酶促反应条件：37℃、20min；漂洗：先用水洗再放入7%醋酸浸泡脱色

四、结果绘画出电泳结果标注：正负极LDH同工酶类型溴酚蓝

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