冻干人纤维蛋白原制品中盐酸精氨酸和甘氨酸的测定

冻干人纤维蛋白原制品中盐酸精氨酸和甘氨酸的测定

高效液相色谱法和氨基酸分析仪是目前氨基酸分析的最有效方法。高效液相色谱法的分析原理主要是基于氨基酸和标准偏差前或后的氨基酸和标准偏差。目前用于反相高效液相色谱检测氨基酸的柱前衍生试剂有近10种,以柱前衍生高效液相色谱法测定纤维蛋白原中的精氨酸也有报道,但其衍生化试剂盒费用高,且需配置荧光检测器。本实验参照《中国药典》二部(2005版)中高效液相色谱法,采用2,4-二硝基氟苯为柱前衍生剂,以紫外吸收检测器在360nm波长处检测,用外标法计算含量,取得了令人满意的效果。材料和方法1.外吸收分离器安捷伦1200系列高效液相色谱仪,配置1314B紫外吸收检测器,为美国Agilent公司产品;YMC-PackODS-AC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)为日本仓光株式会社产品。2.glygly2,4-二硝基氟苯(DNFB)、盐酸精氨酸(Arg·HCl)和甘氨酸(Gly)均为分析纯,Sigma产品;冻干人纤维蛋白原制品①(含Arg·HCl和Gly),批号:FNG20060721A2和冻干人纤维蛋白原制品②(不含Arg·HCl和Gly),批号:FNG20041024A0,均为本公司产品。3.溶液的制备3.1制备准确量取2,4-二硝基氟苯1ml,置于100ml容量瓶中,用乙腈稀释至刻度。3.2缓冲缓冲贮存液的制备称取NaHCO34.2g,用去离子水溶解并定容至100ml,浓度为0.5mol/L,pH9.0。3.3溶解nahs准确称取KH2PO43.4g,置于500ml容量瓶中,用去离子水溶解,再加入0.1mol/L的NaOH145.5ml,用去离子水定容。3.4磺基水杨酸对照品溶液A液:准确称取Arg·HCl和Gly对照品各50.0mg,置于50ml容量瓶中,用30ml去离子水溶解混匀后,再加入8ml磺基水杨酸(1.5%)混匀,用去离子水定容,备用。B液:准确称取Arg·HCl对照品50.0mg,置于50ml容量瓶中,用30ml去离子水溶解混匀后,再加入8ml磺基水杨酸(1.5%)混匀,用去离子水定容,备用。C液:准确称取Gly对照品50.0mg,置于50ml容量瓶中,用30ml去离子水溶解混匀后,再加入8ml磺基水杨酸(1.5%)混匀,用去离子水定容,备用。3.5蛋白质溶液的制备取冻干人纤维蛋白原制品复溶,吸取1.0ml,用4.0ml1.5%磺基水杨酸沉淀蛋白质,3000r/min离心10min,取上清液1.0ml,加入4.0ml去离子水中混匀,备用。4.检测方法4.1层析条件流动相为醋酸钠缓冲溶液/乙腈(80∶20,v/v)。检测波长:360nm;流速:1.0ml/min;进样量:10μl。4.2衍生液添加量按下述检测项目,取适量备用液于10ml容量瓶中,加入衍生缓冲液2.0ml,摇匀,再加入衍生溶液1.0ml,避光,于60℃恒温水浴中衍生1h,取出,放置冷却。加入平衡缓冲液定容,摇匀,放置15min。经0.22μm微孔滤膜过滤,取过滤液进样。4.3保留时间的测量取B液和C液1.0ml,按4.2项衍生化,按4.1项操作,测定盐酸精氨酸和甘氨酸的保留时间。4.4方法特异性验证取A液和人纤维蛋白原制品①复溶液各1.0ml,按4.2项衍生化,按4.1项操作。4.5衍生化剂的选择准确吸取A液0.25、0.50、1.00、1.50和2.00ml,分别置于10ml容量瓶中,依4.2项进行衍生化,按4.1项进样。以质量浓度X(mg/ml)对峰面积Y进行线性回归。4.6复溶人纤维素原制品的制备准确称取适量的盐酸精氨酸和甘氨酸对照品,加入复溶的人纤维蛋白原制品②中,按3.5项制备后,取1ml按4.2项衍生化,再按4.1项检测。4.7重复试验取复溶的人纤维蛋白原制品①,按3.5项制备后,取1ml按4.2项衍生化,按4.1项检测,每隔1h测定1次,共测定6次。结果1.gly的保留时间经检测,Arg·HCl的保留时间为9.338min,Gly的保留时间为10.058min,见图1和图2,保留时间为8.300min处的峰是残留的2,4-二硝基氟苯衍生物。2.方法的特异性研究考察结果,DNFB、Arg·HCl与Gly分离完全,主峰依次为DNFB、Arg·HCl和Gly,见图3和图4。3.hcl和gly衍生化量的线性回归方程分别以盐酸精氨酸和甘氨酸的质量浓度X(mg/ml)对峰面积Y进行线性回归,得Arg·HCl的线性回归方程为Y=6023.8X+17.5(r=0.99998),Gly的线性回归方程为Y=12683.8X-51.5(r=0.99999),表明Arg·HCl和Gly衍生化量在0.25~2.00mg/ml范围内线性关系良好,见图5和图6。4.标准回收率试验经检测,盐酸精氨酸和甘氨酸的平均回收率分别为96.6%和95.4%,见表1和表2。5.两组患者实际检测重复性的比较经重复6次检测,盐酸精氨酸和甘氨酸含量的平均值分别为28.97和18.99mg/ml,CV分别为0.81%和0.97%,表明日间检测重复性较好,见表3。衍生试剂检测方法冻干人纤维蛋白原含精氨酸和甘氨酸作为稳定剂。因此,需对其在成品中的含量进行检测,但目前《中国药典》