2型糖尿病小鼠免疫适应及肾脏病理改变的研究

2型糖尿病小鼠免疫适应及肾脏病理改变的研究

2型糖尿病（t2sd）是一种非胰岛素依赖的糖尿病，占糖尿病患者的90%以上。近30年来,我国T2DM患病率显著增加,成为严重威胁人类身体健康的主要疾病之一。高脂饮食和肥胖是引起T2DM的主要致病因素。建立较为理想的符合人类T2DM发病过程和代谢特征的动物模型,对探讨糖尿病发病机制和评价降糖药物疗效有着非常重要的意义。目前,常用的T2DM动物模型主要有两类:(1)基因突变,基因敲除或转基因动物模型,如ob/ob小鼠、db/db小鼠等。这类动物模型由单基因异常引发疾病,遗传因素占主导作用。其优点是发病进程稳定,缺点是与绝大多数人类T2DM的致病机制不一致;(2)STZ腹腔注射诱导的糖尿病动物模型。STZ对胰岛β细胞有选择性破坏作用,能诱导产生糖尿病。国内外普遍选用雄性大鼠来制备糖尿病模型。大剂量STZ会严重破坏胰岛β细胞,导致胰岛素分泌严重不足,这样获得的疾病模型更接近于1型糖尿病。先给予高脂高糖饮食,模拟人类T2DM的发病过程,再注射小剂量STZ诱导,是建立T2DM动物模型的有效方法。国内外在制备大鼠T2DM模型方面研究较为深入,以小鼠为研究对象的造模研究较少。本文采用高脂高糖饮食再加上多次小剂量腹腔注射STZ的方法制备T2DM模型小鼠,分析了其生化变化和胰岛,肝等组织病理形态变化,旨在了解此小鼠模型是否与人类T2DM的发病过程及病理形态改变一致。1材料和方法1.1实验动物的饲养雄性C57BL/6J,5~6周龄,购于南方医科大学实验动物中心:scxk粤2011-0015。实验动物饲养于南方医科大学细胞生物学清洁级动物房,室温保持在25±2℃,湿度保持在(55±5)%。动物自由进食,自由饮水,每天保持12h的昼夜循环。开始实验前,动物正常饮食饮水,适应环境1周。所有实验操作符合科技部与南方医科大学动物实验伦理委员会的要求。1.2血糖仪和生化仪器STZ(货号S0130),柠檬酸与柠檬酸钠购自Sigma。高脂高糖饲料(NO.0105825)由广东省实验动物中心动物饲料组提供(合格证:SCXK(粤)2008-20002)。罗氏卓越型血糖仪与其试纸购自Roche。胰岛素抗体购自Bioworld。二抗及显色剂二甲基联苯胺(DAB)购自北京中杉金桥。生化仪(型号AU5431),Olympus。柠檬酸缓冲液,柠檬酸:称取2.1g加入双蒸水100ml中配成A液,柠檬酸钠:称取2.94g加入双蒸水100ml中配成B液。A液与B液以1∶1的混合,过滤,pH计测定pH值,调节pH=4.2~4.5。1.32高脂高糖饲料的注射将36只小鼠随机分成3组为:正常组(NC组),高脂饲料组(HC组),高脂饲料加STZ组(HC+STZ),每组各12只。NC组以普通饲料饲养,HC组和HC+STZ组分别以高脂高糖饲料饲养。1个月之后禁食过夜。HC+STZ组以40mg/kg体质量的剂量腹腔注射STZ(100mg/ml溶于柠檬酸缓冲液),24h后再注射等剂量STZ一次。NC组与HC组腹腔注射等体积柠檬酸缓冲液作为对照。STZ注射后HC组和HC+STZ组小鼠继续高脂高糖饲养。每周采取禁食12h鼠尾血测定空腹血糖。空腹血糖值>13.89mmol/L判定为造模成功小鼠。1.4血糖、胰岛素抵抗STZ注射1个月之后进行OGTT实验。实验前小鼠禁食12h,以2g/kg体质量的葡萄糖剂量灌胃。分别在0、0.5、1、1.5、2h采血测定血糖(BG)。用曲线下面积(AUC)来反映糖耐量和胰岛素抵抗。AUG采用简化公式计算:AUG=1/4(BG0h)+1/2(BG0.5h)+3/4(BG1h)+1/2(BG2h)的。1.5血浆样品的制备实验小鼠在注射STZ1月后,处理前禁食12h,摘眼球取血,2000r/min低温离心10min,取血浆保存于4℃冰箱。ALT(丙氨酸氨基转移酶)、尿素氮(BUN)、甘油三脂(TG)、肌酐(CR)、总胆固醇(CHOL)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等生化指标采用全自动生化检测仪(南方医院检验科)进行检测,每个样品用双蒸水稀释3倍后上机测定。1.6小鼠输注后肝脏功能损害模型胰腺组织的免疫组化分析:胰腺用4%多聚甲醛溶液固定24h,常规石蜡包埋,10μm切片,兔抗小鼠胰岛素抗体孵育,常规DAB显色,苏木素复染。肝脏,肾脏组织病理学检测:肝脏组织用4%多聚甲醛溶液固定24h,常规石蜡包埋,10μm切片,苏木素-伊红染色。常规光学显微镜观察。分析高脂饮食加STZ处理小鼠胰岛β细胞的分布及肝脏的病理形态情况。1.7数据处理及分析方法实验各组所有数据都是用SPSS13.0进行统计分析,结果以平均数±标准差表示,多样本之间采用单方向ANOVA进行比较,并用Excel制作相应的图表。P<0.05判为差异有统计学意义。2结果2.1平均血糖含量实验小鼠注射STZ后,每周测定小鼠的空腹血糖,连续检测4周,结果如图1。HC组小鼠1~4周空腹血糖都较NC组略有增加,但还在空腹血糖正常值(6.8mmol/L)范围内。HC+STZ组注射STZ1周后,平均血糖值为14.20±2.46mmol/L,有75%(9/12)的小鼠空腹血糖值大于13.89mmol/L。继续给予高脂高糖饮食,到第2周再测空腹血糖,除1只小鼠死亡外,其余11只小鼠的空腹血糖值均超过13.89mmol/L,平均血糖值为15.12±1.39mmol/L,造模成功率为91.7%(11/12)。第3周平均空腹血糖值较第2周略有下降,血糖值为14.45±1.33mmol/L。第4周平均血糖值又有较大升高,为17.88±3.11mmol/L。整个造模过程,12只小鼠只有1只死亡,死亡率为8.3%(1/12)。2.2小鼠体质量的变化各组实验小鼠在注射STZ前后的体质量变化情况见表1。与NC组相比,经过高脂高糖饲养1月后,HC组和HC+STZ组小鼠体质量都比NC组显著增高(P<0.01)。HC+STZ组在腹腔注射STZ两周后,小鼠的活动度减小;注射STZ1月后,HC+STZ组小鼠毛发蓬松,缺乏光泽,活动度显著下降。在注射STZ1月之后,HC组和HC+STZ组体质量增加不明显,但与NC组相比,体质量依然有显著性差异(P<0.01);HC+STZ组体质量与HC组相比无显著性差异(P>0.05)。2.3小鼠血糖、胰岛素抵抗的变化小鼠在注射STZ1月后的OGTT试验结果如图2所示。HC+STZ组在口服葡萄糖后0、1、1.5、2h的血糖值均显著高于NC组和HC组(P<0.01);HC组口服葡萄糖后,1、1.5、2h的血糖值均高于NC组,但其中只有1.5h血糖值有显著差异(P<0.05),其他时间点血糖值的增高均无统计学差异(图2A)。计算NC组的AUC为20.97±3.38;HC组的AUC为27.41±1.73;HC+STZ组的AUC为45.47±0.98。HC组AUG比NC组略有升高(P<0.05),HC+STZ组AUC则比NC组或HC组显著增高(P<0.01,图2B)。说明HC+STZ组小鼠的糖耐量显著下降,表现为明显的胰岛素抵抗现象。HC组糖耐量略有下降,有轻度的胰岛素抵抗。2.4对脏器滤过功能的影响实验小鼠血浆的生化检测结果见表2。HC+STZ组CR,BUN、ALT等含量与HC组相比都有不同程度的增高趋势,其中HC+STZ组CR较NC组显著增高(P<0.01),也较HC组显著升高(P<0.05)。HC+STZ组和HC组TG和CHOL的含量比NC组略有增高,但无统计学差异(P>0.05)。CR和BUN是反映肾脏滤过功能的指标,而ALT与TG和CHOL分别是反映肝脏损伤和脂质代谢的指标。上述结果表明高脂高糖饮食使小鼠血脂增高,STZ腹腔注射诱发糖尿病后,引起了肾功能和肝功能的病理改变。2.5小鼠胰岛结构的变化,依据dab显色区域差异胰岛β细胞免疫组化检测结果见图2。用抗胰岛素抗体检测胰腺组织中β细胞的分布和胰岛素的分泌水平。图2中团块状的大小和形态不一的黄褐色DAB显色区域即是胰岛结构,细胞核显蓝色,DAB显色的深浅反映胰岛素的分泌水平。NC组DAB显色较深,胰岛结构完整,细胞排列规整。HC组DAB显色较NC组稍浅,胰岛的结构和细胞形态无明显变化。HC+STZ组DAB显色较浅,胰岛内有一个或多个空泡,β细胞排列不规则,有明显萎缩迹象。2.6小鼠肝组织结构检测实验小鼠肝脏组织切片HE染色观察显示(图3,4)。HC+STZ组和HC组小鼠部分肝组织结构中可见空泡样细胞,有轻度脂肪肝样变。3组小鼠肾脏组织未发现明显的病理病理改变。3小鼠的血糖和胰岛素功能变化高脂饮食和肥胖是引起T2DM的主要诱因。约有60%~80%的成年糖尿病患者在发病前均为肥胖者,肥胖的程度与T2DM的发病率呈正比。最新研究显示,高脂饮食和肥胖与炎症及T2DM的发生密切相关。脂肪酸是前列腺素E2、白三烯和血栓环素等炎症介质生物合成的原料。肥胖患者和高脂饮食所致的脂肪堆积会引起体内长期慢性的炎症反应,使胰岛功能受损,并产生胰岛素抵抗。正是由于生活水平的提高,我国近三十年来T2DM的患病率增高了近十倍。以往,糖尿病动物模型的建立多采用大剂量STZ注射方法。大剂量STZ注射会造成胰岛β细胞的大量破坏,制备出的是1型糖尿病动物模型,并且容易引起受试动物大量死亡。低剂量STZ处理,受损的胰岛细胞又常能自我修复,造模成功率较低。本文我们采用高脂饮食结合低剂量STZ多次腹腔注射方法制备T2DM小鼠模型。受试小鼠先接受高脂高糖饮食,产生一定程度的胰岛素抵抗,再用小剂量STZ破坏部分胰岛β细胞,造成胰岛素分泌不足。这样既不会导致β细胞的大量破坏,又可使β细胞不容易自我修复,能更好地诱导实验小鼠往T2DM发展。实验结果显示:实验小鼠给予高脂高糖饮食1个月,小鼠体质量显著增加。注射STZ1周后,有75%(9/12)的小鼠空腹血糖值大于阈值13.89mmol/L。到第2周除1只小鼠死亡外,其余小鼠的空腹血糖值均超过阈值,造模成功率为91.7%(11/12)。注射STZ1个月后的OGTT试验显示,HC+STZ组在口服葡萄糖后1~2h的血糖值均显著升高,AUC显著高于HC组和NC组。说明HC+STZ组小鼠口服糖耐量显著下降,表现为明显的胰岛素抵抗现象。单纯接受高脂高糖饮食的HC组小鼠空腹血糖仍在正常值范围内,但糖耐量有一定程度下降,并出现轻度胰岛素抵抗。提示,单纯高脂高糖饮食很难诱发C57BL/6J小鼠发生典型的T2DM病变。只有在给予长期的高脂高糖饮食的同时,注射STZ选择性破坏部分胰岛β细胞,降低胰岛素的分泌,才能引起糖耐量下降和胰岛素抵抗等典型的T2DM病理表现。生化检测结果显示,高脂饮食的HC+STZ组和HC组小鼠TG、CHOL的含量有增高的趋势,HC+STZ组小鼠ALT升高明显。病理检查显示,HC+STZ组和HC小鼠肝组织见空泡样结构。这些实验结果与成细华等报道的,给予胰岛素抵抗、糖脂代谢紊乱的MKR小鼠高脂饮食所导致的ALT升高和血脂(CHOL、LDL)升高等肝功能损伤指标和脂肪代谢异常基本一致。说明高脂高糖饮食会引起小鼠脂肪肝病变,高血脂、高血糖也会损伤肝脏,导致ALT升高。生化检测结果还显示,HC+STZ组小鼠血浆CR含量显著增高,BUN也有增高趋势,提示有肾小球滤过障碍。长期的高血糖能够引起渗透性利尿,加速肾脏的损伤,影响肾脏的滤过功能。说明高脂高糖饮食结合STZ注射所致的T2DM小鼠已有一定程度的肾功能障碍。但肾脏的病理检查尚未发现明显的结构改变。STZ注射后,第1周小鼠空腹血糖值已有明显升高,第2周进一步升高,第3周略为降低,第4周又大幅升高。此时,小鼠毛发蓬松,色泽灰暗,活动度显著减小。免疫组化结果显示,高脂饮食的HC组小鼠胰岛β细胞胰岛素的分泌量减弱,HC+STZ组表现为胰岛细胞排列紊乱,出现大量β细胞萎缩、空泡化和纤维化的现象。提示高脂高糖饮食会引起胰岛素分泌减少,减弱胰岛功能。STZ对胰岛β细胞有明显的破坏作用。STZ注射后2周内胰岛细胞受损明显,第3周胰岛β细胞有部分修复,但第4周高血脂、高血糖又进一步损伤胰岛功能。高脂饮食结合STZ注射所致的T2DM小鼠模型,模拟了人类高脂饮食和肥胖的发病过程,其血糖的动态变化及病理改变等方面与人类的2型糖尿病的发病情况非常接近,比基因突变T2DM小鼠模型,如db/db小鼠和新西兰肥胖小鼠(NZO)等,更适合用于评价降糖药物的疗效。基因突变T2DM小鼠模型,遗传因素起主导作用,与绝大多数人类T2DM的致病机制