uf020卷柏提取物对血管内皮细胞保护作用的机制研究

uf020卷柏提取物对血管内皮细胞保护作用的机制研究

uf020柏树[selagov.]是柏树科的一种干燥的全草，具有活血和循环的作用。现代药理及临床研究表明,卷柏提取物具有降血脂、降血糖、抗菌、抗病毒、抗辐射、抗氧化、植物雌激素等作用。本实验室前期在采用去势大鼠模型研究卷柏的雌激素样作用时,意外发现卷柏有良好的降血糖、降血脂作用,进而对其化学成分进行了系统研究,从中得到大量黄酮类、木脂素类、酚酸类等成分,通过活性筛选发现卷柏总黄酮(totalflavonoidsofSelaginellatamariscina,TFST)是卷柏降血糖、降血脂的有效部位,而在TFST中穗花杉双黄酮(amentoflavone,AMT,图1)为其主要成分,且近年研究发现AMT在降血脂同时还有抗炎、促进血管新生的作用。鉴于此,本实验以体外TNF-α(tumornecrosisfactoralpha)诱导人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)复制血管内皮细胞损伤模型,从细胞增殖、血管内皮细胞功能、炎症、氧化损伤及对NF-κB信号通路调节等方面来探讨AMT对血管内皮的保护作用及其机制。mtt法检测细胞活力干燥卷柏全草购自本草国药堂责任有限公司,经河南中医学院药用植物教研室陈随清教授鉴定为卷柏科植物卷柏[Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring]。穗花杉双黄酮为本实验室分离得到,HPLC归一化法测定其纯度为98.12%。称取穗花杉双黄酮1.02mg,用适当的溶剂(DMSO)溶解,加入含5%血清的RPMI1640培养基20mL,调至终质量浓度为50μg·mL-1,0.22μm孔径滤膜过滤除菌,4℃冰箱内保存备用。使用时用含5%血清的RPMI1640培养基稀释至所需浓度。取人脐静脉内皮细胞株(HUVEC,河南中医学院第一附属医院李强老师赠送,购自中国典型培养物保藏中心),根据相差显微镜下观察细胞呈单层鹅卵石样排列、免疫细胞化学法染色细胞第VIII因子相关抗原呈阳性,确定培养细胞为内皮细胞。将细胞培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中(含青霉素100u·mL-1,链霉素100u·mL-1),置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,均取对数生长期细胞用于实验。肿瘤坏死因子(Sigma);NO试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒(南京建成生物科技有限公司);VCAM-1、E-selectin、IL-6、IL-8ELISA试剂盒(R&D);兔抗人一抗VCAM-1、E-selectin、IκBα、NF-κBp65、LaminB1(SantaCruz);抗β-actin兔单克隆抗体、山羊抗兔IgG、HRP(北京康为世纪生物科技有限公司);ECL显色试剂盒(北京Solarbio生物科技有限公司);FITCAffiniPureGoatAnti-RabbitIgG(H+L)(美国EarthOx);DYCZ-24DN型垂直板电泳仪、半干转膜电泳槽(北京六一仪器厂);半干转膜仪(GE);iMarkTM型酶标仪(BIO-RAD);BioMate3S型紫外分光光度仪(Thermo);G:BOX凝胶成像仪(Syngene);激发光共聚焦显微镜FV1000(Olympus)。收集对数生长期细胞,按细胞数1×104/孔接种于96孔培养板,每孔含细胞悬液200μL;置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育,细胞贴壁后弃上清液;分为5组:对照组和穗花杉双黄酮(3.72×10-3、7.43×10-3、11.15×10-3及14.87×10-3mol·L-1)组,每组6个复孔,培养一定时间后,每孔加入MTT20μL,继续孵育4h,弃培养液,每孔加入DMSO150μL,于酶标仪490nm测定吸光度(A)值。细胞存活率(%)=(给药组A值-对照组A值)/对照组A值×100%。细胞培养同“MTT法检测细胞活力”。收集经药物处理的HUVEC细胞,制成细胞数为1×106的单细胞悬液;PBS洗涤后离心沉淀细胞,70%乙醇4℃固定过夜,800×g离心5min弃上清液,留下约50μL的单细胞悬液;加入RNase溶液100μL,37℃水浴孵育30min,然后加入PBS800μL、PI染色液50μL,避光染色30min后进行FCS检测。诱导剂TNF-α配制:取10μg包装的TNF-α,用无菌的超纯水1mL溶解,分装10份(100μL/份),保存于-20℃,用含5%血清的RPMI1640培养基稀释至所需浓度。实验分为6组,正常组(control);模型组(MC,TNF-α10ng·mL-1);AMT-I组(AMT3.72×10-3mol·L-1+TNF-α10ng·mL-1),AMT-II组(AMT7.43×10-3mol·L-1+TNF-α10ng·mL-1),AMT-III组(AMT11.15×10-3mol·L-1+TNF-α10ng·mL-1),AMT-IV组(AMT14.87×10-3mol·L-1+TNF-α10ng·mL-1);其中AMT组在加入TNF-α12h后加入AMT共同作用12h,HUVEC细胞培养及检测方法同“MTT法检测细胞活力”。实验分组与给药同“MTT法检测TNF-α诱导的HUVEC细胞增殖实验”。收集对数生长期细胞,按细胞数1×104接种于96孔培养板,每孔含细胞悬液200μL,置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中孵育;细胞贴壁后弃上清液,给各组加药,每组6个复孔;作用一定时间后,分别收集上述经药物处理的细胞上清液,3000×g离心20min,无菌管收集上清液冻存于-20℃。按照试剂盒的操作检测NO的含量。NO含量(μmol·L-1)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度(100μmol·L-1)×样品测试前稀释倍数实验分组与加药培养同“MTT法检测TNF-α诱导的HUVEC细胞增殖实验”。细胞因子VCAM-1、E-selectin、ET-1、IL-6及IL-8的分泌情况均采用ELISA试剂盒检测。向预先包被细胞因子抗体的微孔板中加入标准品、待测样本和辣根过氧化物(HRP)酶标记的细胞因子抗体,经过温和洗涤,去除未结合的组分,然后加入底物A、B显色,最后加酸终止反应。用酶标仪在450nm波长检测A值,通过标准曲线计算样品中细胞因子浓度。实验分组与加药培养同“MTT法检测TNF-α诱导的HUVEC细胞增殖实验”。收集各组经药物处理的细胞,按总蛋白提取试剂盒说明书操作,提取总蛋白。得蛋白饼后,加入适量2%SDS水溶液,95℃加热10min溶解蛋白,4℃过夜,12000×g离心5min,吸取上清液。另外,收集各组经药物处理的细胞,按胞浆/核蛋白提取试剂盒操作,提取胞核蛋白,95℃煮10min溶解蛋白,4℃过夜,12000×g离心5min后吸取上清液。蛋白浓度测定按总蛋白测定试剂盒(BCA法)说明书操作,经SDS电泳分离后电转移至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭2h,加入一抗VCAM-1(1∶400)、E-selectin(1∶400)、IκBα(1∶800)、NF-κBp65(1∶200)、β-actin(1∶3000)及LaminB1(1∶400),4℃孵育过夜,加入二抗山羊抗兔(1∶2000),于37℃孵育1h,ECL化学发光试剂盒显色,X光片显影,用SyngeneG:BoxChemiXR凝胶分析系统对蛋白条带进行分析。将细胞接种于放有盖玻片的6孔板中,孵化24h,实验分组与加药培养同“MTT法检测TNF-α诱导的HUVEC细胞增殖实验”。取出作用一定时间的盖玻片,用PBS洗数次,用4%多聚甲醛4℃固定15min,PBS漂洗3次,然后0.3%TritonX-1004℃透膜10min,PBS漂洗。10%BSA湿盒室温封闭1h后,用一抗孵化(NF-κBp65,1∶100),4℃湿盒中过夜。PBS漂洗3次后,用FITC标记的二抗(1∶50)避光孵化1h,PBS避光漂洗,滴加PI避光室温孵育30min,PBS避光漂洗3次。最后,待爬片晾干,用封片剂封片,使用激发光共聚焦显微镜观察,尽快照相。HUVEC细胞培养同“MTT法检测TNF-α诱导的HUVEC细胞增殖实验”。药物作用一定时间后取上清液,检测SOD活性和MDA含量(严格按照试剂盒的说明书进行)。实验数据以ue0af±s表示,采用单因素方差分析(one-wayANOVA)进行组间差异的比较。结果1amt对huvd细胞活力的影响前期实验已经筛选出AMT对HUVEC细胞的最佳作用时间为12h,有效剂量在3.72×10-3~14.87×10-3mol·L-1。本研究在最佳时效、量效范围下,考察了AMT促HUVEC细胞活力作用:与对照组相比,AMT3.72×10-3、7.43×10-3、11.15×10-3及14.87×10-3mol·L-1剂量组均可显著升高HUVEC细胞存活率(%),分别为(103.36±0.96)%、(117.93±1.02)%、(131.93±1.31)%和(128.01±0.78)%(P<0.05,P<0.01)。2图12为了进一步探讨AMT对细胞增殖的作用机制,对细胞周期的影响进行了检测(图2)。与对照组相比,AMT3.72×10-3、7.43×10-3、11.15×10-3及14.87×10-3mol·L-1剂量组的HUVEC细胞的S期百分比均有显著升高(P<0.01,表1)。3amt对小鼠huvd细胞活力的影响由上述结果可知,AMT对HUVEC细胞有促存活的作用,前期实验已确认诱导剂TNF-α在24h、10ng·mL-1时对HUVEC细胞损伤效果最佳,本实验在上述实验结果的基础上,检测了AMT对TNF-α诱导的HUVEC细胞活力的影响。与正常组相比,模型组的细胞存活率显著降低为(63.27±0.68)%(P<0.01);与模型组相比,AMT3.72×10-3、7.43×10-3、11.15×10-3及14.87×10-3mol·L-1剂量组均可使细胞存活率有显著升高,分别为(68.21±1.03)%、(79.09±1.12)%、(87.96±0.79)%和(80.56±0.85)%(P<0.01)。4elisa,amt检测由上述结果可知,AMT对损伤的HUVEC细胞仍有增殖作用,故检测其对内皮细胞功能的调节作用。与正常组相比,模型组的NO含量显著降低(P<0.01),ET-1蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,AMT可使NO含量显著升高(P<0.01),ET-1蛋白表达显著降低(P<0.05,P<0.01),见表2。ELISA结果(表3)提示:与正常组相比,模型组的IL-6和IL-8表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,AMT可使IL-6及IL-8表达显著降低(P<0.01)。ELISA结果(表3)提示:与正常组相比,模型组VCAM-1和E-selectin蛋白表达均显著升高(P<0.01);与模型组相比,AMT可使VCAM-1及E-selectin蛋白表达显著降低(P<0.01)。为了验证上述结果,采用了Westernblotting法检测VCAM-1、E-selectin蛋白表达,蛋白表达条带(图3A和3C)的凝胶成像定量分析结果显示:与正常组相比,模型组VCAM-1、E-selectin蛋白表达均显著上调(P<0.01);与模型组相比,AMT可使VCAM-1、E-selectin蛋白表达均显著下调(P<0.05,P<0.01),见图3B和3D。7各组bp65蛋白表达的比较Westernblotting法检测NF-κB信号通路中NF-κB的抑制蛋白IκBα和胞核蛋白NF-κBp65的表达(图4A和4C);凝胶成像结果显示:与正常组相比,模型组IκBα蛋白表达显著下调,胞核蛋白NF-κBp65表达显著上调(P<0.01);与模型组相比,AMT可显著上调IκBα蛋白表达,使胞核蛋白NF-κBp65表达显著下调(P<0.05,P<0.01),见图4B和4D。8amt检测nf-bp65的表达FITC标记的NF-κBp65显示绿色荧光,PI标记的细胞核显示红色荧光,两种荧光细胞图像叠加时颜色的变化,可反映NF-κBp65在细胞核内外的表达情况。结果如图5所示,随着AMT浓度的增加(0~11.15×10-3mol·L-1),荧光由黄色到橘色,提示NF-κBp65从胞浆迁移进入胞核量的由多到少,即NF-κB的活性强度逐渐减弱。结果提示AMT在一定浓度范围内(3.72×10-3~11.15×10-3mol·L-1)能抑制NF-κBp65向胞核迁移,并呈剂量依赖关系。9amt对sod和mda的影响与正常组相比,模型组的SOD活性显著降低(P<0.01);与模型组相比,AMT可使SOD活性显著升高(P<0.01)。与正常组相比,模型组的MDA含量显著升高(P<0.01);与模型组相比,AMT可使MDA含量显著降低(P<0.01),见表2。amt的作用机制动脉粥样硬化是一种常见疾病,有文献证实血管内皮损伤是AS(atherosclerosis)发生发展的始动环节。因此保护血管内皮免受各种刺激因子损伤,是抗AS的重要环节。本实验室前期在对去势大鼠脂代谢研究中发现卷柏提取物对腹主动脉内皮具有一定保护作用,且卷柏提取物中的主要成分是AMT,本实验首先采用MTT法检测AMT对HUVEC细胞活力的作用,实验结果表明,AMT显著促进HUVEC细胞的存活率,主要是使S期细胞比例增加。本研究进而探讨了AMT对TNF-α诱导损伤的HUVEC细胞内皮功能的修复作用,血液中ET-1/NO水平的变化能够反映内皮的功能状态,两者平衡的破坏是动脉内皮受损的显著特征。AMT可使TNF-α诱导损伤的HUVEC细胞的上清液中NO含量升高,ET-1水平降低。提示AMT可能对血管内皮具有保护作用。炎症反应产生的细胞因子在AS的形成中起了极其重要的作用。VCAM-1与E-selectin在内皮激活状态下表达增加,是AS形成的主要起始阶段的关键因子,而IL-6、IL-8可进一步诱发炎症反应的产生,加剧AS的形成。本实验结果显示,AMT可抑制黏附因子VCAM-1、E-selectin和炎症因子IL-6、IL-8的表达,提示AMT可能有保护血管内皮免遭炎症损伤从而保护血管内皮的作用。NF-κB是参与炎症反应的重要转录因子。TNF-α可激活NF-κB,使其从IκBα三聚体解离为NF-κB(p50/p65),随后p50/p65从胞浆迁移入胞核中,与胞核中的特异性增强子元件结合介导下游多种生物活性物质的表达,