基于改进的融合pcr技术的同源重组序列构建

基于改进的融合pcr技术的同源重组序列构建

随着大规模重组计划的完成和大规模表达序列标记数据库（dap）的建立，结果基因组的研究逐渐从结构矩阵转变为功能基因组的研究。以同源重组技术为基础,通过构建突变或缺失的同源媒介基因载体并取代基因组中野生型的等位基因,进而研究目的基因与表型性状间的关系,是研究动物、植物、微生物基因功能的一种非常有用的遗传操作方法。同源重组的发生依赖于载体与目的片段间存在一定的DNA序列同源片段,同源片段越长越有利于同源重组事件的发生。传统的同源重组载体的构建以限制性内切酶和DNA连接酶为基础,通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力,不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列,而且对于长片段的连接有时难以找到合适的酶切位点。为了克服传统的同源重组载体构建方法的缺陷,出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术(fusionPCR)。融合PCR技术在不需要内切酶消化和连接酶处理的条件下,采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来,为同源重组片段的构建提供了快速简捷的途径。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应:(1)应用特异性引物,对各片段进行独立扩增,特异性引物的5′末端带有一段相邻片段的互补序列;(2)在同一反应体系中加入各片段的混合物,以一对外侧引物进行融合片段的全长扩增。由于融合PCR技术正处于初步发展阶段,在应用过程中还存在很多方面的问题,如融合产物长度一般在4.0kb以下、待融合片段的个数一般不超过3个、产物特异性差等。Robert等应用融合PCR方法进行了3个片段的融合反应,获得了3个融合产物,融合产物长度最大为4.2kb。Majid等在进行4个片段的连接时,首先将425bp的alcA启动子片段和1.9kb的pyr4基因片段连接到pUC19载体上,得到一个2.1kb的pyr4-alcA表达盒,再通过两步PCR将2.1kb的pyr4-alcA表达盒与两个长度分别为410bp和513bp的片段进行了融合,最终才获得了一个由4个片段组成的长3.0kb的融合产物。鉴于融合PCR技术中普遍存在的问题,本研究对现有的融合PCR技术进行了改进,构建了3个同源重组线性DNA片段(Albr和Blhr由3个片段融合而成,Clbrh由4个片段融合而成),并对改进的融合PCR技术的操作步骤、反应条件及技术要点进行了详细的论述。与原有的技术相比,改进的融合PCR技术增加了一个反应步骤,通过3个PCR反应,在一个反应体系中即可以快速实现3个片段和4个片段的融合反应。融合产物电泳条带清晰,产物特异性强,产物的长度分别达到了4.5kb、5.2kb和5.9kb。1材料和方法1.1材料表面1.1.1pcsn43研究哈茨木霉(Trichodermaharzianum)T88菌株、大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109、质粒pCSN43均由本实验室保存;质粒pBT6购自美国真菌遗传保存中心(FungalGeneticsStockCenter,FGSC)。1.1.2培养基的制备马铃薯培养基(PDA):马铃薯200g,蔗糖20g,蒸馏水至1000ml;LB培养基:蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,固体培养基添加15g琼脂,去离子水至1000ml,固体和液体培养基在使用时按需要加入氨苄青霉素至100μg/ml、X-gal(40μg/ml)、IPTG(10μg/ml)。1.1.3enymemamax和gel花图PfuDNAPolymerase,LongPCREnzymeMix购自Fermentas公司;GelExtractionMiniKit购自上海华舜生物工程有限公司;pMD18-T载体购自宝生物(大连)有限公司。1.2dna分子手术基因组DNA的提取、纯化,质粒DNA的提取、转化均参照文献。1.3pcr扩增产物本实验分别构建了3个同源重组线性DNA片段(Albr,Blhr,Clbrh),Albr和Blhr由3个片段融合构成,Clbrh由4个片段融合构成。每个片段的融合反应均设了3次重复,各片段扩增所用引物及序列如表1所示。其中引物Al1、Al2、Ab1、Ab2、Ar1与Cl1、Cl2、Cb1、Cb2、Cr1序列相同,大写序列为扩增片段的特异性引物序列,小写序列为相邻片段的互补序列。1.4扩增条件及产物检测按照常规PCR方法进行各目的片段的独立扩增。扩增使用PfuDNAPolymerase,各片段扩增的反应条件及扩增产物长度如表2所示。扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的条带,切胶GelExtractionMiniKit回收。凝胶制备过程中减少EB的加入量,要求EB浓度一般低于0.15μg/ml。1.5ssr-pcr融合dna片段的制备测定各回收产物中目的片段浓度,在50μl体系中加入等摩尔的待融合片段(要求DNA总量不少于800ng),不添加引物,使用PfuDNAPolymerase进行各片段的互补延伸,以形成全长的融合PCR产物(中间产物)。反应条件及中间产物长度如表3所示。1.6融合片段的扩增、检测以中间产物为模板,在50μl体系中依次加入ddH2O,5μl10×LongPCRbuffer(MgCl215mmol/L),2.5μldNTPs10mmol/L,引物各1μl20μmol/L,模板10μl,LongPCREnzymeMix0.5μl,进行融合片段的全长扩增。扩增反应条件如表4所示。扩增产物用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,确定目的条带,切胶GelExtractionMiniKit回收。回收产物克隆T载体,蓝白斑筛选阳性菌落并菌落PCR鉴定,选取鉴定正确的阳性克隆测序。2结果2.1哈茨木霉微管蛋白基因下游调控区序列及扩增产物的扩增同源重组片段Albr由3个片段融合而成,同源重组左臂Al,选择标记基因Ab和同源重组右臂Ar,长度分别为1.6kb,2.0kb,1.0kb(图1a)。其中Al为哈茨木霉β微管蛋白基因上游调控区序列;Ab为苯并咪唑抗性基因;Ar为β微管蛋白基因下游调控区序列。电泳分析结果表明,扩增产物长度为4.5kb,与预期的片段大小相同。产物条带清晰,特异性强,无其它非特异性条带产生。实验设3次重复,电泳结果相同,均获得了目的片段。目的片段经回收纯化克隆T载体,并挑取阳性克隆进行测序,测序结果证实了扩增产物的正确性,同源重组片段Albr在扩增过程中无突变发生。2.2同源重组片段albr-mbr扩增为了明确两同源臂之间的长度差异是否影响片段间的融合,本实验进行了Blhr的融合扩增。同源重组片段Blhr由3个片段融合而成,同源重组左臂Bl,选择标记基因Bh和同源重组右臂Br,长度分别为3.2kb,1.4kb,0.6kb(图1b)。其中Bl为哈茨木霉β微管蛋白基因编码区及上下游调控区序列;Bh为潮霉素抗性基因;Br为β微管蛋白下游调控区旁侧序列。电泳分析结果表明,扩增产物长度为5.2kb,与预期的片段大小相同。产物条带清晰,特异性强,无其它非特异性条带产生。所设3次重复电泳结果相同,均获得了目的片段。目的片段的测序结果证实了同源重组片段Blhr的正确性,扩增过程中无突变发生。由目的条带的亮度来看,片段Blhr的产率约为100ng/μl,片段Albr的产率约为400ng/μl。结果表明,同源重组片段两同源臂间无论是否存在长度差异,反应均可以得到特异性强、含量高的融合产物。2.3扩增产物的扩增同源重组片段Clbrh由4个片段融合而成,同源重组左臂Cl,正选择标记基因Cb,同源重组右臂Cr和负选择标记基因Ch,长度分别为1.6kb,2.0kb,1.0kb,1.4kb(图1c)。其中Cl为哈茨木霉β微管蛋白基因上游调控区序列;Cb为苯并咪唑抗性基因;Cr为β微管蛋白基因下游调控区序列,Ch为潮霉素抗性基因。电泳分析结果表明,扩增产物包括3个片段,其中最大的片段长度为5.9kb,与预期的目的片段大小相同,其余两个片段长度均在1kb以下,推测为非特异性条带。所设3次重复电泳结果相同,均获得了目的片段。目的片段的测序结果证实了同源重组片段Clbrh的正确性,扩增过程中无突变发生。片段Clbrh的产率约为80ng/μl,与Albr和Blhr的融合反应相比,尽管产物得率稍低,且有非特异性片段产生,但通过对目的条带的纯化、克隆,仍然可以得到所需的目的融合片段。3融合pcr技术本实验通过对原有融合PCR技术进行改进,成功地构建了3个同源重组线性DNA片段。改进的融合PCR技术主要包括三个反应步骤(图2):待融合片段的独立扩增(StepA);各片段间的融合反应(StepB),添加第一步反应的已纯化产物,不添加引物,通过10～13个循环,复性延伸片段之间的重叠部分;对各融合片段的全长扩增(StepC),将第二步反应的未纯化产物,添加外侧引物进行25～30个循环。应用融合PCR技术进行片段的连接,操作过程中的注意事项包括:(1)通过引物设计使待融合片段间形成一定长度的互补区域,互补区域的长度取决于待融合片段的长度;扩增片段的特异性引物序列(表1中的大写序列)要求具有相近的退火温度。(2)模板量大,要求待融合片段等摩尔混合,并且50μl体系中总DNA量不少于800ng。(3)用于回收待融合片段的凝胶中减少EB的加入量,通常要求浓度低于0.15μg/ml;切胶过程中避免紫外线对模板的直接照射,减少紫外线间接照射时间。可以考虑以PCR产物纯化试剂盒代替胶回收试剂盒,避免EB及紫外对模板造成的损伤。(4)融合片段的获得需要三个步骤的PCR反应,第一步及第二步PCR反应要求使用具有3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶。如果使用的DNA聚合酶在PCR产物的3′末端产生polyA尾,当相邻片段间的互补区域退火以后,3′末端的polyA尾将阻止延伸反应的进行,无法得到全长的融合产物。(5)在使用具有3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶时,为防止引物降解,操作应严格限制在冰上进行,并推荐使用热启动PCR技术。本研究中通过将配制好的PCR反应液从冰上迅速置于预热的PCR仪,达到了较好的扩增效果。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应,Robert等使用两步PCR反应获得的3个融合片段,长度分别为4.0kb、4.1kb、4.2kb。Hidekazu等使用同样的方法进行3个片段的融合反应,得到的片段长度为4.1kb。除此之外,Hidekazu等对两步PCR反应获得的融合产物进行电泳分析发现,产物条带背景弥散,并伴有非特异性条带产生,说明产物特异性较差。改进的融合PCR技术在原有的两步反应中增加了一个步骤,将各待融合片段等摩尔混合,在不添加引物的条件下先进行11～13个循环,这种方法大大地提高了产物的特异性,减少了非特异性条带的产生,而且使获得的融合产物长度高达5.9kb。对于4个片段的连接反应,除传统的通过酶切连接的方法将各个片段逐个连接到载体上外,Majid等采用的方法是,首先将两个片段连接到载体上构成一个片段,再将这个片段与另外两个片段通过两步PCR反应进行融合,这两种方法都需要限制性酶切位点的存在,费时费力。改进的融合PCR技术通过三步PCR反应,可以在一个反应体系中实现4个片段的快速融合,大大缩短了反应所需时间,降低了反应操作难度。本实验对各融合反应均进行了三次重复操作,得到了相同的实验结果,表明实验操作性强,具有可重复性。对各产物的测序结果均未