高热稳定性极端酶的研究进展

高热稳定性极端酶的研究进展

在极端环境中有许多微生物。它们可以在火山口的高温下生存，有些可以生长在寒冷的极上，有些可以承受海底深度的高压，有些可以在ph值为0.3或ph值为10.12的环境中生存，有些可以在5%-30%的环境中保持沉默。人们把这些适于生存在高温、高压、高酸、高碱以及高盐浓度下的这一类微生物称之为嗜极端微生物。最近10年,有许多的嗜高温极端微生物被分离出来,它们甚至可在沸水中生长。最高生长温度达103～110℃的极端微生物包括Pyrobaculum、Pyrodictium、Pyrococcus以及Methanopyrus等种属。在细菌中,Thermotogamaritima和Aquifexpyrophilus能生存的最高温度分别是90℃和95℃。迄今为止,已经发现了60多种嗜热的细菌和古细菌。它们包括好氧和厌氧的化能无机自养型菌和异养型菌。后者能够利用多种多聚物,如淀粉、半纤维素、蛋白质。这些微生物的代谢过程和特殊的生物学功能,是由在极端条件下的酶和蛋白质的功能所决定的。从这些嗜热极端微生物中分离出来的酶显示了独特的特性:具有极高的热稳定性,通常能抵抗化学变性剂如表面活性剂、有机溶剂和高酸高碱环境。其催化功能优于目前在各种工业生产中应用的酶。因此,可以将这些酶作为设计和构建工业上具有新特性的蛋白质的模型而加以应用。本文主要讨论嗜热(最适生长温度70～80℃)及超嗜热(最适生长温度85～100℃)微生物(古细菌和细菌)在生物工程中的重要意义,并将着重讨论直链淀粉酶、支链淀粉酶、环化糊精糖基化转移酶、纤维素酶、木聚糖酶、蛋白酶以及葡萄糖异构酶、DNA聚合酶等胞内多聚物降解酶,这些酶在食品、化学、医药工业以及环境生物技术中具有很大的应用潜力。1淀粉水解酶的分离和活性淀粉是由α-葡萄糖单元通过α-1,4或α-1,6糖苷键组成,分为直链淀粉和支链淀粉。由于淀粉有复杂的结构,要降解淀粉需要多种酶。这些酶可被简单地分为2类:外切酶和内切酶。内切酶如α-淀粉酶(EC3.2.1.1),外切酶如β-淀粉酶(EC3.2.1.2)。能够水解α-1,6糖苷键的酶被定义为支链淀粉酶或普鲁兰酶(EC3.2.1.41),根据其底物的特性,又可将普鲁兰酶分为I型和Ⅱ型,I型能特异性地水解支链淀粉和低聚糖的α-1,6糖苷键,Ⅱ型能够水解支链淀粉、低聚糖及多糖的α-1,4和α-1,6糖苷键。长期以来,由于缺乏在100℃以上耐酸的高热稳定性酶,淀粉转化为葡萄糖和果糖的生物转化过程必须在控制各种因素的条件下进行。常规的多级生物处理工艺(第1步:pH6.0～6.5,95～105℃;第2步:pH4.5,60～62℃;第3步:pH7.0～8.5,55～60℃)常常伴随着形成并非需要的高浓度的盐类。在最后一步需得到高浓度的高果糖浆,必须用昂贵的离子交换器除去盐类。因此具有高热稳定性的淀粉水解酶的发现,对改进工业淀粉转化工艺是非常有意义的。来源于超嗜热极端微生物的淀粉酶在100℃以上、适合的pH值下具有很高的活性。分离高热稳定性及具有嗜热活性的酶的详细研究已经作了不少。来源于Pyrococcuswoesei,Pyrococcusfuriosus和Thermococcusprofundus的热稳定性α-淀粉酶已经被鉴定,这些酶的最适活力温度分别为100、100、80℃。在嗜热极端微生物的一些种属Sulfolobus、Desulfuroloccus、Thermococcus和Staphylothermus中也观察到淀粉水解酶的活性。最近,一个来源于P.furiosus的编码胞外α-淀粉酶的基因已经被克隆,其重组酶已在Bacillussubtilis中进行了表达。这个来自P.furiosus的胞外α-淀粉酶在缺乏多种离子的状态下所表现的热稳定性(最高可在130℃中具有活性)以及其独特的生产模式和底物特异性使它在工业应用中备受瞩目。来自P.furisus的编码胞内α-淀粉酶的基因也被克隆并且进行了表达。研究同时发现,在一些淀粉酶中常常出现的4个高保守区域没有在该淀粉酶中出现。目前,一些具有耐热活性的α-淀粉酶已经应用于工业生产,如来自Bacilluslicheniformis、T.maritima的淀粉酶通常被用于淀粉的液化作用,但后者的淀粉酶活性显著依赖于Ca2+的存在。2普鲁兰酶型在Thermocococcuseler、Desulfurococcusmucosus、Staphylothermusmarinus及Thermococcusaggregans中,人们已经分离出了具有高热稳性和嗜热活性的普鲁兰酶。Cauganella等发现,这些普鲁兰酶的最适温度在90～105℃之间,甚至在缺乏底物和Ca2+的条件下,它们还有显著的热稳定性。关于该酶的大多数研究着重于普鲁兰酶Ⅱ型。该酶已从P.furiosus和Thermococcuslitoralis中被分离纯化。来自P.woesei的普鲁兰酶Ⅱ型的基因已在大肠杆菌中表达,纯化的重组酶的最适温度为100℃,在110℃的条件下仍然具有一半活力。1997年Dong等将来源于P.furiosus的编码普鲁兰酶Ⅱ型的基因在大肠杆菌中进行了克隆和表达。这些具有嗜热稳定性的酶能水解α-1,4和α-1,6糖苷键,从而可以改进工业上淀粉水解工艺。好氧嗜热菌Thermuscaldophilus生产一种高热稳定性的普鲁兰酶I型,该酶的最适温度为75℃,最适pH为5.5。在90℃以上依然有稳定性,但它的稳定性和活性并不依赖于Ca2+。1997年Koch等首次从一个厌氧耐热菌Fervidobacteriumpennavorans中分离鉴定了普鲁兰酶I型。最近,编码该酶的相关基因已在大肠杆菌中进行了克隆和表达。与来自P.woesei的普鲁兰酶相比较,来自F.pennavoransVen5的普鲁兰酶专一性地水解多糖的α-1,6糖苷键。这是目前知道的唯一一种专一水解支链淀粉的嗜热稳定性支链淀粉酶,该酶通过水解支链淀粉可以形成长链线性多糖,而后者是葡萄糖淀粉酶的理想底物。3环化糊精co-染色环化糊精糖基化转移酶(CGTase)(EC2.4.1.19)以随机的方式水解多糖的α-1,4键,并通过胞内分子转糖基作用转化淀粉,该反应的非还原性环化产物包括α、β、γ-环化糊精,分别由6、7或8个葡萄糖分子组成。CGTase主要在工业上应用于环化糊精的产生。CGTase可将多种有机分子聚集成包含复合体,这意味着该酶能在水溶液中提高疏水化合物的溶解性。环化糊精的生产由多级工艺步骤完成:第1步,淀粉被热稳定性淀粉酶液化;第2步,用来自Bacillussp.的CGTase进行环化反应,因为CGTase的稳定性较差,该工艺过程必须在两个不同的温度下进行。来自极端微生物的热稳定好、特异性高的CGTase将解决这个问题。它可使液化作用和环化在同一步进行。具有高热稳定性的CGTase已经在Thernoamaerobactersp.中发现,Wind等也从Thermoamaerobacterthermosulfurgenes中发现了该酶。最近Powe从肯尼亚的Bogoria湖中分离和鉴定了一个新的菌株Anaerobrancabogoriae,并在该菌株中分离纯化了一个嗜热、嗜碱的很稳定的CGTase,其最适生长温度为65℃,pH为10。4其他纤维素酶纤维素占植物生物量的40%以上,它由葡萄糖单元通过β-1,4糖苷键连接而成,其多聚物包括15000个葡萄糖单元,以完全线性模式存在。虽然纤维素有较高的亲水性但它却不易溶解。天然纤维素化合物结构是非均质性的,它既有非晶态区域也有有序的晶体区域,结晶的程度依赖于纤维素的来源和高晶体区域,该区域能够抵抗酶的水解。纤维素水解为葡萄糖至少需要3种不同的酶的协同作用而完成,它们是:内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶(纤维素水解酶)及β-葡萄糖苷酶。纤维素酶(EC3.2.1.4)广泛存在于真菌和细菌中,并已经应用于多种生物工艺。目前在工业中广泛应用的是来自于Trichodermasp.的纤维素酶,该酶还可在Aspergillus、Penicillium和Basidiomycetes中得到。纤维素酶应用于乙醇生产中可以提高产量,应用于洗涤剂中可以使被清洗物颜色鲜艳柔软,并有效去除特殊的油污。另一些纤维素酶可以应用于饲料谷物的前处理以改善其营养价值,工农业废料的纤维素酶化处理能生产优质的化学产品。具有高热稳定活性的纤维素酶对晶态纤维素进行高效水解在生物工程中应用前景广阔。已有一些来自超嗜热微生物的纤维素酶的基因被克隆,重组酶也得到纯化和鉴定。Bronnenmeiar将一种来源于T.maritimuMSB8的纤维素酶进行了酶学特征分析。该酶分子质量为4.455×10-17?kg,最适温度为95℃。最适pH在6.0～7.0之间。另有两个高热稳定性内切纤维素酶CelA、CelB可从Thermotognneapolitana中得以分离纯化,CelA(4.785×10-17kg)的最适pH为6,最适温度为95℃;CelB(4.95×10-17kg)有较宽的pH范围,编码这两个内切纤维素酶的基因已经被鉴定。存在于嗜热厌氧菌Caldocellumsaccharolytium基因组中编码纤维素酶和半纤维素酶的基因是以基因簇的形式存在的,在该菌的培养中以纤维素和半纤维素作为碳源。编码纤维素酶(CelA)的基因已被分离,该基因编码1751氨基酸。这是目前为止知道的最大编码纤维素酶的基因。来自T.maritimaMSB8的高热稳定性外切纤维素水解酶的分子质量为4.785×10-17kg,最适温度95℃,pH6.0～7.5,在95℃中有一半的活力。该酶能水解微晶纤维素、羧甲基纤维素和β-葡聚糖形成纤维二糖和纤维三糖。从Thermotogasp.F3SS3-BC中分离得到的纤维二糖酶有非常高的热稳定性,在115℃、pH6.8～7.8时有最大活力,该酶的热稳定性是依赖盐的,该酶能降解非晶体状态的纤维素和羧甲基纤维素。1991年,Grogen在sufolobussolfataricusMT4、Sulfolobusacidocalarius、sulfolobusshibatae中发现了β-糖苷酶,Kengen1993年在P.furiosus中也发现了该酶。在P.furiosus中的β-糖苷酶为同源四聚体(9.24×10-17?kg亚基),在102～105℃时非常稳定并有最适活力,在100℃、3.5d和110℃、13h该酶有一半活力。来自S.solfataricusMT4的β-糖苷酶已被纯化鉴定,该酶是一个同源四聚体(8.25×10-17?kg亚基),85℃以上时对各种变性剂有非常高的抵抗力,活力很高。编码该酶的基因已经在大肠杆菌中克隆和高效表达。5木聚糖酶n-fm木聚糖是一个非均质的分子,是构成半纤维素的主要多聚化合物。木糖的完全降解需要以下几种酶的作用。即内切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.18)、外切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.1.37)阿拉伯糖酶(EC3.2.1.55)、葡糖醛酸阿拉伯糖木聚糖内切β-1,4-木聚糖酶(EC3.2.136)、乙酰基木聚糖酯酶(EC3.1.1.6),它们在生物技术中应用广泛,应用于禽类的饲料添加剂中可提高其营养价值,应用于面粉中以提高烘烤产品的质量。近几年,高热稳定性的木聚糖酶主要应用于造纸业中的酶辅助漂白技术中。在美国,每年有超过2×106?t的氯及氯的衍生物被用于纸浆的漂白,氯化木质素衍生物的产生给环境带来严重的污染问题。近来研究者已证实用耐热木聚糖酶代替氯及其衍生物,可以避免污染问题同时减少纸浆成分的损失。在高温下,木聚糖酶可以打开细胞壁,在漂白阶段促进木质素的去除,而目前市场上的木聚糖酶在70℃以上时迅速变性,因此,用这些酶处理纸浆时,必须先将纸浆冷却处理后再加热以进行下一个工艺步骤,既浪费时间和能量,又比较繁琐。迄今为止,只发现少数几种超嗜热极端微生物能分泌具有高热稳定活力的木聚糖酶。其中大多数来自Thermotogasp.FjSS3-B.1、T.maritime、T.neapolitana以及Thermotogathermarum。这些酶主要在80～105℃具有酶活。几个编码木聚糖酶的基因已经被克隆和测序,来自T.maritima的木聚糖酶基因在大肠杆菌中被克隆和表达。经比较研究发现,该酶比目前用于造纸业中的最好的木聚糖酶更具有应用价值。6执法性蛋白质的调节作用目前所有的商用生物蛋白酶(EC3.4.1.1～3.4.4.25)根据其活性中心可分为以下几种类型:丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶及含金属蛋白酶等。蛋白酶的生产规模和产量非常大,丝氨酸碱性蛋白酶用于日化用品可以抵抗去污剂和强碱条件下导致的蛋白质变性。蛋白酶所显示出的高角蛋白酶活性和酯酶活性在皮革工业中的浸透过程是非常有用的。蛋白酶还常用于肽链合成的催化过程及逆转录反应。一些蛋白酶还可在高热高碱条件下进行催化反应,这在工业中的应用很有价值。来源于古细菌的多种热稳定性蛋白酶已被分离鉴定。它们大多数属于丝氨酸蛋白酶类型,它们在高温、高浓度的去污剂以及变性剂存在的条件下稳定性极好。来自DesulfurococcusSY的蛋白酶在95℃下培养4.3h依然有一半活性。来自T.stetteri的胞外蛋白酶分子质量为11.22×10-17?kg,耐高热、可抵抗化学变性剂,在100℃下培养2.5h有一半活性。一个编码类似枯草杆菌中性蛋白酶的丝氨酸蛋白酶的基因已从Pyrobaculumaerophilum中克隆出来,该酶被用作研究枯草杆菌中性蛋白酶基本结构的模型。在Pyrococcusfuriosus中也观察到丝氨酸蛋白酶活性。该蛋白酶具有很高的热稳定性,在105℃下培养20min有一半的活性。编码该酶的基因已被克隆和测序,该酶也是一个类似枯草杆菌中性蛋白酶的丝氨酸蛋白酶。来自嗜热菌的F.pennavorans的一种高热稳定性的丝氨酸蛋白酶已被鉴定,该酶可以水解角蛋白,形成氨酸基和多肽,该酶的最适温度为80℃,最适pH为10。除了丝氨酸蛋白酶以外,有些其它类型的蛋白酶也被分离和鉴定。如来自Pyrococcussp.KOD1的巯基蛋白酶及来自P.furiosus的一种丙基多肽酶等7pcr扩增极端基因的途径DNA聚合酶(EC2.7.7.7)是DNA复制时的关键酶。目前有100多个从各种微生物中包括嗜热极端细菌和古菌发现的DNA聚合酶的相关基因已经被克隆和测序,几种天然的和重组的DNA聚合酶已被纯化鉴定。在近10年分子生物学研究领域中最重要的进步之一就是PCR技术的问世和发展。在PCR技术中,DNA聚合酶起着关键性的作用,Taq酶既是从栖热菌Thermusaquaticus中分离纯化而得到的第一个应用于PCR的高热稳定性酶。然而Taq酶有5’-3’的外切活性,但是没有3’-5’的外切活性,因此该酶不能很好地保证PCR产物的保真性。具高保真性的高热稳定性DNA聚合酶近年已陆续出现,这些酶普遍具有3’-5’外切核酸酶活性,如来自古细菌Pyrococcuswoesei的PwoDNA聚合酶,来自Pyrococcusfuriosus的PfuDNA聚合酶以及来自PyrococcusstrainGB-D和Thermuslitoralis的VentDNA聚合酶,与Taq