深海海水中主要微生物群落结构及其生理功能

深海海水中主要微生物群落结构及其生理功能

海洋面积约占地球总面积的70%，平均深度为3.800m，海床上的平均压力为38mpa。海洋以下的许多地质结构具有不同的物理性质，如沉积、海洋地壳、热液口和冷泉。多样的地质结构孕育了丰富多彩的生命,构成了地球上生命特别是微生物的最大生态系统(Schrenketal.,2010)。对于黑暗海底生命的探索可以追溯到20世纪30年代,美国Scripps海洋研究所的ClaudeZoBell等发现在海床下数厘米至数米范围内的深海沉积物内存在细菌(ZoBell&Anderson,1936);1977年,美国“Alvin”号深潜器首次在太平洋的加拉帕戈斯(Galapagos)洋中脊发现了深海热液喷口和热液生态系统(Corlissetal.,1979);Parkes等(1994)通过大洋钻探,在海床下数百米深的沉积物样品中发现了具有活性的微生物。从前面所述的这些早期偶然性的海底勘测,到逐渐通过大洋钻探项目来系统组织开展的系统性探测,人类已经认识到在地球上存在两个大规模的生物圈:一个是我们所熟知的由光合作用维持的地表生物圈;另一个是存在于地球深部由化能作用支持的黑暗深部生物圈,这也是长期被人类所忽视或者说由于探测手段的限制而刚刚开始认识的。目前来看,尽管深部生物圈的研究仍处于起步阶段,但基于它潜在的巨大影响力,业已成为全球生物学家和地质学家研究的共同热点和焦点。新的大洋科学发现计划(2013–2023年)更是将深部的生命研究作为其四个研究主题之一,即其中的深部生物圈前沿:深部生命、生物多样性和生态系统的环境因子。所有已知的生命形式都需要获得足够的能量和碳源来维持生存和生长。在深部缺乏阳光的黑暗环境中,生物主要通过氧化还原反应获得能量,通常的电子供体包括氢气,甲烷,有机物质,还原的硫化物,还原的矿物质如铁、镁、铵等;电子受体包括分子氧,硝酸盐,亚硝酸盐,镁和铁氧化物,硫氧化物(如硫酸盐、亚硫酸盐),二氧化碳等。深海不同生境分布有不同类型的电子供体和受体,这些差异直接导致了微生物的多样性和生物地理分区(McCollom,2000;Bach&Edwards,2003;Expedition336Scientists,2011)。深部其他环境条件如高温(或低温)、高压也是影响微生物分布和多样性的重要因素。本文将尝试从不同的深海环境分区来认识深海微生物的分布和多样性。1海底1.1海底海水的微生物群落位于海平面以下200–1,000m的中远洋带和大于1,000m的远洋带,是一个完全没有光照的环境。微生物群落主要以海水中颗粒有机物(particulateorganicmatter,POM)和溶解有机物(dissolvedorganicmatter,DOM)作为碳源和能源(Aristeguietal.2002),以硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等无机物作为营养源,分子氧是主要的电子受体。随着深度的增加海水温度逐渐降到2–4℃,栖息于此的微生物主要是中温菌和嗜冷菌。与此同时,压力也随着海水深度的增加而增大(10MPa/km),微生物对压力的耐受能力也逐渐增强,并普遍具有耐压/嗜压特性(Bartlett,1999)。海水中的微生物种类分布也随着深度(压力)的增加和易降解利用碳源(labileorganiccarbon,LOC)的逐步减少而呈现明显的差异(Moesenederetal.2012)。深海海水主要的细菌类群有Alphaproteobacteria(Rickettsiales和Rhodospirilliaceae),Deltaproteobacteria(SAR324clade和Nitrospina)Gammaproteobacteria(Colwellia,Shewanella,Alteromonas,Pseudoalteromonas),Chloroflexi(SAR202clade),Actinobacteria,Deferribacteriales,SAR406和Agg47clades(DeLongetal.,2006;Zaballosetal.2006;Phametal.,2008;Brownetal.,2009)。其中α-,γ-变形菌是海水中最主要的微生物类群(Zaballosetal.,2006)。通过对不同深度、不同区域海水的细菌群落组成进行比较发现,它们呈现类似的全球分布。例如Chloroflexi中的SAR202clade在大西洋百慕大观测站和太平洋夏威夷观测站的海水中都有发现,约占微生物群落的10%(Morrisetal.,2004),然而由于没有纯培养的物种,它们的功能至今尚不得而知。1.2膜脂化合物类深海海水中的主要古菌类群有海洋底栖古菌群和海洋古菌群。其中海洋古菌群I(MG-I)是主要类群(Delongetal.,1994;Fuhrman&Ouverney1998;Karneretal.,2001)。DeLong等(1994)在海水环境rRNA基因测序中首次发现并定义了MG-I古菌。在3,000m以下的深海海水中,MG-I古菌是原核超微型浮游生物的主要组分(Karneretal.,2001)。Pearson等(2001)通过分析MG-I类古菌的膜脂的稳定碳同位素,发现这些古菌能利用无机碳源,意味着这类古菌可能是自养的,具有利用并固定CO2的功能。而Ouverney等(2000)发现,MG-I类古菌可以分解氨基酸,说明这类古菌可能是兼性自养或具有丰富的代谢多样性。Könneke等(2005)发现,MG-I类古菌在自养生长的同时,还具有氨氧化的能力。2微生物与生物地球化学深海沉积物主要是由上层海水中的颗粒物沉降到海底并不断堆积而形成的,覆盖了近乎整个海底,厚度从新形成洋壳上部几厘米的空间,到大陆边缘和深海沟的几千米不等(Fryetal.,2008)。海洋沉积物中的化学反应和运输主要通过扩散进行,当然,在一些流体活跃的位点如甲烷渗漏区和泥火山也存在物质的平流运输。由于受到技术条件的限制,当前深海沉积物中生命的研究主要集中在有机物含量丰富的大陆架边缘的表层沉积物(沉积物厚度<1m),并已经获得了大量的微生物群落组成与多样性方面的数据(Schrenketal.,2010)。而随着深海采样装备的发展,科学家逐渐有机会接触到广阔的深海平原(约占陆地面积的80%)和海底以下几百米到几千米的深部环境(Sievertetal.,2008;Expedition336Scientists,2011;Scientists,2011)。总体来说,深海沉积物中微生物含量的多少与沉积物中的有机物含量和距离大陆板块的距离有关(Lippetal.,2008;Kallmeyeretal.,2012),栖息在沉积物中的微生物以异养微生物为主。在大陆架边缘的表层沉积物中,强烈的化学梯度和高浓度的有机物保证了微生物高的细胞活性,微生物含量在108–109cells/cm3(D’Hondtetal.,2004)。随着沉积物深度增加,能源物质和营养元素浓度逐渐减少并趋于稳定,微生物的含量和细胞活性缓慢下降,在100m内微生物含量保持在106–107cells/cm3(Parkesetal.,2000)。而在远洋的深海平原区域,沉积物中微生物含量比大陆架边缘低2–3个数量级。D’Hondt等(2009)在SouthPacificGyre深海平原表层沉积物中检测到的微生物含量更低,仅为103–104cells/cm3。但是,由于广阔的深海平原蕴含了地球上1/10到1/2的微生物含量(Whitmanetal.,1998;Parkesetal.,2000;Kallmeyeretal.,2012),是研究碳、氮等元素的生物地球化学循环和生命起源的场所,也是当前海洋微生物生态学研究的热点之一(Fang&Zhang,2011;Orcuttetal.,2011;Edwardsetal.,2012;Røyetal.,2012;Wangetal.,2013)。沉积物中的氧气主要来源于上层海水的扩散作用,而氧气是微生物最容易利用的电子受体,因此好氧微生物通过氧化沉积物中的有机物获得能量,并具有极高的代谢活性,这导致氧浓度在沉积物几毫米到几厘米处迅速耗尽,而沉积物中的硫酸盐、硝酸盐、铁和锰等为微生物提供了更丰富的电子供体(D’Hondtetal.,2004)。沉积物中最重要的有机物降解途径是硫酸盐还原,占大陆架沉积物有机物降解的25–50%(Jørgensen,1982;Reeburgh,1983;Christensen,1989;Canfieldetal.,1993),而其他代谢途径因地域和营养源的差异呈现不同的全球分布。例如,硝酸盐还原和铁还原代谢途径主要分布在江河的入海口,或者是有陆源尘埃搬运作用影响的近海区域(Brust&Waniek,2010)。由于有机物降解会产生大量的CO2,这些CO2与H2会被产甲烷菌用于合成甲烷。据估计大约有10%的有机物被产甲烷菌转化成CH4(Claypool&Kvenvolden,1983),因此CH4产生途径也广泛存在于深海沉积物中。深层沉积物环境中,非生物成因的H2与CO2可以被微生物利用合成乙酸(Leveretal.,2010;Lever,2011),沉积物中的硫化物、铁、锰矿物的氧化还原等过程也是深部生物圈环境重要的代谢途径(Jørgensen&Nelson,2004)。与此同时,在沉积物和洋壳的交界处,洋壳流体携带的电子受体如氧气、硫酸盐等扩散到沉积物中,为沉积物中的微生物提拱了相当可观的营养元素(Engelenetal.,2008;Linetal.,2012)。除了有机物,CH4作为重要的碳源和能源物质,对微生物的分布和活性具有重要影响。过去十多年来我们对甲烷代谢相关微生物的研究取得了重要的进展。其中有突破性的发现是,CH4从海洋沉积物释放到上层水体的过程主要由微生物控制。根据16SrRNA基因的系统发育分析,认为厌氧甲烷氧化菌(ANME)有3个类群(ANME1,2,3),不同环境分布有不同的ANME类群(Nauhausetal.,2002,2004)。但是,这些ANME类群生物地理分布的决定因子仍不清楚。直到现在科学家还未能在实验室获得ANME或SRB的纯培养物,但已成功获得ANME的富集物,其代时约3–7个月(Zhangetal.,2011)。近年来发现,ANME尤其是ANME-2能够固氮(Dekasetal.,2009),并且海洋沉积物中的甲烷氧化能够与铁、锰还原耦联(Bealetal.,2009)。在大陆架边缘区域,冷泉和泥火山为微生物提供了充足的CH4,与CH4代谢相关的微生物在这些区域大量繁殖且具有非常高的活性(Zhangetal.,2010)。特别是在沉积物中的硫酸盐—甲烷转换带(SMTZ),厌氧甲烷氧化古菌(ANME)和硫酸盐还原细菌(SRB)具有较高的丰度和活性(Treudeetal.,2003;Joyeetal.,2004)。沉积物中的微生物群落组成随着氧浓度、温度、营养元素的种类和含量以及沉积物的深度等物理化学参数的变化而各不相同。有氧的表层沉积物微生物的多样性相对较高,总体来说,主导细菌类群有α-,δ-,γ-变形菌(Alpha-,Delta-&Gammaproteobacteria),酸杆菌(Acidobacteria),双歧放线菌(Actinobacteria),以及浮霉菌(Planctomycetes)(Bowman&McCuaig,2003;Polymenakouetal.,2005,2009;Lietal.,2008)。在冷泉区,甲烷氧化和硫酸盐还原是主导的代谢途径,因此硫酸盐还原菌Deltaproteobacteria和甲烷氧化菌ANME是主导微生物(Boetiusetal.,2000;Zhangetal.,2011)。对于深层沉积物而言,有机物含量丰富的区域未培养的细菌类群OP9/JS1的含量较高,在有机物含量较低的区域则是绿弯菌(Chloroflexi)和变形菌(Proteobacteria)相对含量较高(Inagakietal.,2003,2006;Newberryetal.,2004;Websteretal.,2006)。而对于高温的沉积物来说,表层和深层的沉积物群落结构一致,ε-变形菌(Epsilonproteobacteria)含量较高,微生物的群落结构与深海热液区域的微生物组成类似(Teskeetal.,2002;Nercessianetal.,2005)。深海沉积物中的古菌含量丰富,但与这些古菌16SrDNA序列有较好亲缘关系的多数类群一般尚无培养菌株。近年来,随着深海钻探和采样技术的发展,辅以高通量测序、宏基因组技术、rRNA基因和功能基因研究,我们逐渐认识了一些主要的古菌类群。海洋底栖古菌群B组(MBG-B)被发现是许多采样点和沉积物样品的古菌16SrRNA克隆文库中的主要类群(Vetrianietal.,1999)。MBG-B古菌最初是在深海沉积物的表层(Vetrianietal.,1999)及热液口(Takai&Horikoshi,1999)发现的,之后,人们又在其他热液口(Reysenbachetal.,2000;Teskeetal.,2002)低温沉积物表层(Reedetal.,2002;Inagakietal.,2003)甚至冷泉区的表层沉积物中(Knitteletal.,2005),都发现MBG-B是主要的古菌群落。可以说,MBG-B古菌在各种深海沉积物的生境中都有广泛的分布,不过在不同生境中生长的MBG-B也是有所不同的。研究表明,在热液口发现的MBG-B大多在进化树的根部,而在低温沉积物中发现的MBG-B则大多位于进化树的冠部(Teske,2006)。另有研究结果表明,厌氧甲烷氧化或许可以直接或间接地刺激MBG-B古菌的生长(DeLong,1992)。另一个主要的古菌类群是海洋古菌族I(MG-I)。之前提到,MG-I最早是在海水中发现的(Fuhrman,1992;DeLong,1992),所以沉积物中这一类群的起源问题一直引人关注。目前有系统发育分析认为,沉积物中的部分MG-I类群,是由底层海水中的MG-I自然入侵并逐渐分化而来(Sørensenetal.,2004)。和MBG-B、MG-I不同,MBG-A和MBG-D仅存在于部分采样点和沉积物样品中,且通常不是主要的古菌类群。这两类古菌最初是在大西洋大陆架表层沉积物及新英格兰近海的深海平原发现的(Vetrianietal.,1999)。与MG-I不同的是,这两类古菌并没有在底层海水中发现,意味着它们是沉积物中特有的底栖古菌。此外,杂古菌类群MCG(miscellaneouscrenarchaeoticgroup)也是深海沉积物中主要的古菌类群之一。MCG的生活环境比MBG-B还要广泛,在陆地和海洋、高温和低温、表层和基底的各种环境中均有分布(Teske,2006),且具有代谢活性。对富含MCG的沉积物的碳同位素标记分析,发现这一古菌类群有代谢埋藏有机碳的能力(Biddleetal.,2006)。与MCG类似,SAGMEG(南非金矿广古菌群)也是在陆地和深海沉积物中均有分布(Reedetal.,2002;Inagakietal.,2003,2006;Parkesetal.,2005;Websteretal.,2006)。16SrRNA分析表明,SAGMEG与MCG一样,都具有代谢活性(Sørensen&Teske,2006)。此外,AAG(古老古菌群)和MHVG(海洋热液群)这两支靠近生命系统发育进化树根部的古菌群,也在深海沉积物中有所发现(Takai&Horikoshi,1999;Inagakietal.,2003;Sørensen&Teske,2006)。总体上讲,随着分子生物学技术的不断发展和进步,过去30年我们对沉积物中微生物尤其是微生物多样性的认识取得了巨大的飞跃,然而我们对微生物尤其是未培养微生物的生物地球化学作用的认识仍然非常有限,刚刚开始。深入认识和了解沉积物中微生物多样性、分布与环境的相互作用关系,揭示未培养微生物的生态学功能和生理特征还有相当的路程。在全球范围内将微生物多样性与功能及地球化学作用相互联系仍然面临巨大的挑战。3化能自养微生物洋壳中的岩石体积约是海洋沉积物总体积的6–10倍。岩浆沿洋脊不断涌出,随着远离洋脊,洋壳板块在不断冷却中变重,直至海沟处潜入或俯冲到地幔内。总体上讲,海底每年形成的新洋壳约21km3,平均6,100万年洋壳完成一次再循环(Pollacketal.,1993)。洋壳主要由基性、超基性岩构成,含有丰富的铁、硫、镁等矿物。洋壳中流体的体积占到全球海水的2%,是地球上最大的含水系统(Johnson&Pruis,2003)。玄武岩是顶层洋壳的主要岩石组分,含有丰富的还原性的铁、锰、硫化物矿物,例如二价铁约占9%,二价锰和硫化物各约占0.1%,为微生物提供了相当可观的能量和营养源,而岩石中有机物含量极低(0.01%)。仅有的个别数据表明,暴露在海水中的洋壳表面的微生物丰度在105–109cells/g之间。而人们对洋壳深部和沉积物覆盖的洋壳中微生物的丰度和多样性还不了解,它们与洋壳年龄、蚀变程度和深度的关系也没有定论。基于我们对大西洋西侧翼NorthPond洋壳样品的初步研究结果显示,水深4,400m以下,约100m厚沉积物覆盖的玄武岩基底洋壳微生物的丰度在104–105cells/g之间,物种多样性较低(待发表)。通过洋壳铁和硫的氧化速率建立数学模型,可推算出洋壳中微生物无机自养代谢的初级生产力与海洋沉积物中有机异养代谢的生产力相当(Bach&Edwards,2003),并且在环境样品总DNA中检测到了与碳固定相关的关键基因(Masonetal.,2008)。因此参与到铁、锰、硫等关键代谢反应的洋壳微生物可能主要是化能自养微生物(Bach&Edwards,2003),目前人们对洋壳中铁氧化还原微生物的组成以及玄武岩中的铁的生物转化机制还不了解。分子系统发育学研究发现,玄武岩细菌具有高度多样性,优势菌群为变形菌门(尤其是α-,δ-变形菌),放线菌门(Actinomyce),拟杆菌门(Bacteroide),绿弯菌门,厚壁菌门(Firmicutes)和浮霉菌门(Masonetal.,2008;Santellietal.,2008;Orcuttetal.,2011)。仔细分析细菌16SrRNA基因的多样性数据,可以发现细菌的生物地质物理分布在一定程度上与不同生境的地质学、地质化学和物理学特征相关,甚至有一些类群专属于深部环境(Edwardsetal.,2011)。对于铁氧化细菌,常见的类群有α-变形菌中的Hyphomona和Rhodobacter,β-变形菌中的Gallionella,γ-变形菌中的Marinobacter,以及ζ-变形菌中的Mariprofundus(Santellietal.,2008;Emersonetal.,2010;Edwardsetal.,2011)。对于铁还原菌,有报道从玄武岩中分离得到了希瓦氏菌(Shewanellafrigimarina,Shewanellaloihica)(Lysnesetal.,2004;Gaoetal.,2006),并且在玄武岩环境样品总DNA中检测到了与铁还原有关的功能基因(Masonetal.,2008)。锰氧化也是洋壳微生物获得能量的一个重要的代谢途径(Thorsethetal.,2003;Teboetal.,2005;Templetonetal.,2005)。目前从洋壳环境发现的锰氧化菌类群主要有厚壁菌门中的Bacillus,γ-变形菌中的Marinobacter和Pseudoalteromonas,α-变形菌中的Sulfitobacter和Actinobacteria(Dicketal.,2006;Masonetal.,2008)。玄武岩中以矿物形式存在的硫化物(如黄铁矿)也为微生物的生长提供了能量(Bach&Edwards,2003)。目前已报道的在洋壳中发现的硫氧化菌非常少,ε-变形菌常在海洋硫氧化的环境中检测到,也在个别玄武岩样品中有发现,同时铁氧化菌也可能参与硫氧化。对洋壳中微生物参与的氮循环的了解目前还是一片空白。总体来说,玄武岩洋壳中的氮含量非常低(平均2ppm)(Marty,1995),洋壳流体中也几乎不含氮,只有在完全没有沉积物覆盖的洋壳可以从底层海水获得约40μmol/L的硝酸盐和微量的铵盐。通过对环境样品总DNA氮代谢相关基因的检测发现,固氮、氨氧化和反硝化等代谢途径的关键基因都存在于洋壳微生物中(Masonetal.,2008),说明洋壳微生物具有多样化的代谢氮源的潜能。Planctomycetes,Nitrosococcus和Nitrosospira在个别洋壳环境中都有发现(Masonetal.,2007;Santellietal.,2008),其中Planctomycetes是已知的厌氧氨氧化菌,Nitrosococcus和Nitrosospira通常可以进行好氧氨氧化作用。4热液口微生物群落组成深海热液口发生于板块的交界处与洋壳扩张的区域,主要分布在洋中脊。洋中脊是地球表面最长的、连续的地貌,也是地球上最大的岩浆作用带,在全球洋底的覆盖面积约60,000km2。自从1977年科学家第一次在加拉帕戈斯发现深海热液口(Corlissetal.,1979),人们对研究深海热液生态系统的兴趣与日俱增,紧接着在世界各个大洋都发现了众多不同种类的热液口。深海热液口被认为是地球深部的窗口,海水下渗到海底以下两、三千米和高温岩浆相互作用,将金属元素带上形成富含还原物质的热液从海底喷出(Reysenbachetal.,2000),洋壳中的流体在热液口附近被加热到100–300°C(白烟囱)后喷出(Kelleyetal.,2005),有的甚至被加热到400°C(黑烟囱)以上(Kelleyetal.,2002)。热液流体中携带有大量还原性的物质(氢气、硫化物、金属离子)与周围氧化的冰冷的海水(2–4°C)相互混合,形成几百米到几千米的热液羽流。热液口附近形成巨大的温度和化学梯度,为微生物的生长提供了充足的能源和营养元素。深海热液微生物的群落结构主要取决于热液喷口的类型和周围海水中的微生物类群,微生物丰度也比周围的海水高3–4个数量级(Sunamuraetal.,2004)。高温的、剧烈的水岩物理—化学反应作用形成的金属矿床和喷出的液体是微生物的理想生境,反应产生的大量不稳定的还原的物质可作为微生物的能量来源,是化能合成驱动的热液口生态系统的基础(Reysenbachetal.,2000)。由于热液流体中的O2在加热和水岩相互作用过程中被迅速消耗殆尽,厌氧代谢是热液口流体中的主导代谢途径。化学物质的多样性和动态变化导致了古菌和细菌的高度多样性:不同热液口间微生物群体组成不同,单一热液口随着化学和温度梯度微生物分布也不同,同时热液口的不同发育阶段也存在不同的微生物(Huberetal.,2002;Pagéetal.,2008;Wangetal.,2009)。最近的研究结果表明,热液口微生物的群落组成主要由热液流体的化学组成决定,尤其是H2的浓度直接影响了微生物群落的结构组成(Floresetal.,2011)。Auguet等(2009)分析了古菌在全球不同环境中的分布和多样性,发现深海热液口和淡水水域中的古菌多样性最高,并且指出了一些深海热液口的特有古菌类群,如泉古菌门的热变形菌纲(Thermoprotei),广古菌门的古丸菌目(Archaeoglobales),热球菌目(Themococcales),甲烷球菌目(Methanococcales),奇古菌门的SMTDHV(CrenarchaeotaGroup2)等。Takai等人(1999)又补充了一些类群,如AAG(古老古菌族),SMTDHVCrenarchaeotaGroup1,甲烷嗜热菌目(Methanopyrales),纳古菌门(Nanoarchaeota),海洋热液群1和2(MHVG-1&-2)等。古丸菌目中有研究较多的硫酸盐还原菌和产甲烷古菌。热球菌目是热液环境中最常发现并分离的古菌。它们是严格厌氧、具有硫还原能力、异养的超嗜热微生物。甲烷球菌属(Methanococcus)和甲烷嗜热菌属(Methanopyrus)均嗜热,最适生长温度98°C,最高可达110°C。Xie等(2010)通过宏基因组分析证实了热液口群落的代谢独特性,代谢途径中富集了DNA错配修复基因、同源重组和基因水平转移。Auguet等(2009)通过比较深海热液口特征指示古菌群落和其他环境中的古菌类群,推测深海热液环境可能是地球上古菌的起源地。我们利用高温高压培养系统,从深海热液环境分离出了一系列超嗜热嗜压厌氧古菌,包括迄今唯一1株绝对嗜压超嗜热古菌(Zengetal.,2009)。对深海热液口古菌的探索将丰富我们对生命极限和起源的认识和理解。深海热液羽流和烟囱体中的细菌多样性也非常丰富,主要取决于热液口的类型、年龄和热液流体的化学组成。在热液羽流中最重要的能量代谢是单质硫和硫化物的氧化(McCollom,2000),未培养ε-变形菌(SUP01)和γ-变形菌(SUP05)等占据主导地位(Sunamuraetal.,2004;Sievertetal.,2008;Walshetal.,2009)。其他的主要代谢途径还有好氧甲烷氧化(γ-变形菌中的I型和X型甲烷氧化菌)(Elsaiedetal.,2004)、氨氧化(γ-变形菌,β-变形菌中的Nitrosomonas和Nitr