核仁小分子rna的分类及基因组织研究

核仁小分子rna的分类及基因组织研究

糖核酸（rn）可分为两类：一类是编码蛋白质的糖核酸，称为糖核酸（mrna）；另一种是除糖核酸（mrna）之外的钠。在不同的生物学研究领域中,后者有不同的名称:在真核生物中,人们称其为非编码RNA(NoncodingRNA或non-messageRNA,分别简称ncRNA、nmRNA);在细菌及古细菌中,人们又常把这一类RNA称为sRNA(smallRNA)。ncRNA不仅包括人们早已熟悉的tRNA和rRNA,还包括核内小分子RNA(snRNA)、核仁小分子RNA(snoRNA)、小分子干涉RNA(siRNA)、微型RNA(miRNA)、以及Xist(x(inactive)-specifictranscriptRNA)和Tsix(序列与Xist相反,对其进行调控的一种ncRNA)等。SnoRNA是非编码RNA中研究得最多,了解得最详细的成员之一。1体虫和果蝇中核仁小分子rna的出现和净化核仁小分子RNA在真核生物中普遍存在,人们在脊椎动物、酵母、植物、锥体虫和果蝇中都发现了核仁小分子RNA,在古细菌中也发现了snoRNA的同源物。根据保守序列和结构元件snoRNA可分成三类:boxC/DsnoRNA、boxH/ACAsnoRNA和MRPRNA。1.1box-dstorna扩增BoxC/DsnoRNA序列的5′端含boxC(5′PuUGAUGA3′),3′端含boxD(5′CUGA3′),两端有4-6nt的反向重复序列,形成碱基互补配对的茎状结构。链的中部,通常有另一组C、Dbox,它们的保守性没有C、Dbox那么强,故被称为C′、D′box.。C′、D′box.之间的距离为3-9nt。Dbox(或D′box)的上游有一段与靶标RNA互补的序列,称作AE序列(antisenseelements),每一AE序列长10-21nt,与靶标RNA(如rRNA)的特异序列互补,指导该靶标RNA的2′-O-核糖甲基化修饰,见图1。绝大多数BoxC/DsnoRNA的功能为指导rRNA或snRNA甲基化修饰,古细菌中的BoxC/DsnoRNA同源物可指导rRNA或tRNA甲基化修饰。古细菌中具有两段AE区(即有两个甲基化功能位点)的BoxC/DsnoRNA比较普遍,且它们的靶标位点通常位于同一RNA分子,两个位点距离很近。1.2整体结构和多样性BoxH/ACAsnoRNA具有“发夹-铰链-发夹-尾”的典型结构。绞链区和尾部分别具有Hbox(ANANNA)和ACAbox保守序列元件,ACAbox通常距3′末端三个核苷酸的距离。绝大多数H/ACAsnoRNA指导RNA假尿嘧啶化修饰,即指导RNA分子由尿嘧啶向假尿嘧啶的转换。这类snoRNA的一个或两个发卡结构的第一环通常存在两段与靶标RNA上待修饰的尿嘧啶侧翼序列互补的序列,从而形成长达9-13bp的snoRNA-靶RNA双链结构。这两段序列也称为AE序列。待修饰尿嘧啶距snoRNA下游H或ACA元件约14-16个核苷酸,这是决定假尿嘧啶化修饰的关键,见图2。目前,在真核生物中发现的boxH/ACA类snoRNA的作用对象为rRNA和snRNA等,而古细菌中的BoxH/ACAsnoRNA同源物目前仅发现作用于rRNA。随着对snoRNA研究物种范围的扩大和研究工作的不断深入,人们发现snoRNA的结构存在多样性。这种多样性在带给人们诧异的同时也大大拓宽了人们寻找snoRNA的视野,使得更多的snoRNA得到鉴定。例如,在锥体虫中发现的BoxH/ACAsnoRNA只有单个发夹结构,在古细菌中发现了单个甚至三个发夹结构的BoxH/ACAsnoRNA。而且,snoRNA的序列元件也存在多样性。如酵母U86snoRNA的Dbox序列不是典型的CUGA,而是CGGA,古细菌BoxH/ACAsnoRNA中的三发夹snoRNAAfu-4的第二个ACAbox是AGA;目前发现的锥体虫的单发夹BoxH/ACAsnoRNA都只有位于3′末端的AGAbox。1.3rp的核酸化第三类是MRPRNA,它为核蛋白分子RNaseMRP的唯一核酸成分,仅发现于真核生物体内,在所有真核生物25S—28SrRNA的产生中发挥作用。MRPRNA有着与前两类snoRNA不同的、更加复杂的结构。1.4分子学习中的分子搭配传统意义上的分子伴侣是指帮助蛋白质分子折叠的蛋白质,它是蛋白质分子伴侣。对应的,一些snoRNA能帮助rRNA前体折叠,所以人们把它们称为RNA分子伴侣。迄今发现的具有分子伴侣作用的BoxC/DsnoRNA有U3、U8、U14、U22;BoxH/ACAsnoRNA有snR10、snR30。有一些snoRNA有双重功能,如U14,它在生物体内既能够指导18SrRNA的甲基化修饰,又能作为分子伴侣参与18SrRNA的成熟及核糖体的形成。又如snR10,既可指导25SrRNA的假尿嘧啶化修饰,又作为分子伴侣参与18SrRNA的合成。SnoRNA分子伴侣现象不仅存在于真核生物细胞中,也极有可能存在于古细菌中。1.5orphansenna在植物和动物中,人们发现了一些snoRNA,它们的功能可能是指导RNA的修饰,但目前尚未找到它们的靶标。这些snoRNA被称为“OrphansnoRNA”。例如,脊椎动物端粒酶RNA的3′端有一典型的H/ACA区,对端粒酶发挥作用致关重要,也能被四种BoxH/ACAsnoRNP核心蛋白识别,但人们还没有找到它的靶标,故它也属于OrphansnoRNA的范畴。OrphansnoRNA功能之谜一直令众多生物工作者倾注了大量的热情与汗水,或许谜底揭晓之时就是人们对生物体调控机理重新认识之日。1.6假尿醛化修饰值得一提的是,近年来人们还发现了一类特殊的snoRNA,它们兼具BoxC/D和H/ACAsnoRNA的典型结构和功能,既可指导RNA聚合酶Ⅱ转录的U1、U2、U4及U5snRNA的甲基化修饰,又可指导其假尿嘧啶化修饰。由于这类snoRNA特异性地存在于螺线体(cajalbody)中,因此被称为scaRNA(smallCajalbody-specificRNA)。此类RNA为什么只特异存在于螺线体中?它和典型snoRNA有什么起源关系?这一怪异儿是BoxC/DsnoRNA和BoxH/ACAsnoRNA的混血儿,还是这两姐妹的母亲?又或是它们的同胞姐妹呢?这些疑问尚待进一步研究方能解决。2形态功能相关蛋白的变化SnoRNA与相关蛋白结合成snoRNP才能发挥作用。BoxC/DsnoRNA的结合蛋白有fibrillarin(酵母中为NOP1P)、NOP56P、NOP58P(酵母中为NOP5P)、Snu13P。NOP58P与BoxC/DsnoRNA的稳定性有关,而fibrillarin和NOP56P与其甲基化功能有关。BoxH/ACAsnoRNA的结合蛋白为NAP57(酵母中为cbf5P,人类中为dyskerin,果蝇中为NOP60B),Nhp2p,NOP10p,Gar1P。Cbf5p与假尿嘧啶功能有关,它与细菌中为所有tRNAT环假尿嘧啶化的催化蛋白TruB同源。有些snoRNA除主要的结合蛋白外还有其它结合蛋白。如参与rRNA合成的BoxC/DsnoRNAU3在酵母中与28种蛋白质结合,除构成BoxC/DsnoRNP的4种基本蛋白外,还有17种U3特异的结合蛋白。3storna基因具有独立基因编码的基因团随着snoRNA家族的扩大及复杂性的提高,snoRNA的基因组织形式(snoRNAgeneorgnization)近年来也倍受关注。snoRNA的基因组织主要有4种形式:独立基因编码的snoRNA见(图3a)、多顺反子snoRNA基因簇(见图3b)、内含子编码的snoRNA(见图3c)和内含子编码的snoRNA基因簇(见图3d)。独立基因编码的snoRNA基因组织具有经典真核基因的结构与表达特征:单顺反子编码,有自己独立的启动子和终止子及相关的其它顺式调控元件。内含子编码的snoRNA位于基因的内含子中,作为宿主基因(hostgene)转录产物mRNA前体的一部分,经转录后的加工从内含子中释放出来。多顺反子snoRNA由多个snoRNA基因紧密连锁,串联在一起,共用相同的启动子,以多顺反子前体的形式表达,而后再加工成熟。内含子snoRNA基因簇位于同一内含子当中,各snoRNA串联成簇前后排列。并不是所有生物体内都存在四种组织形式,大多数脊椎动物的snoRNA产生于编码蛋白的内含子中,植物snoRNA多以基因簇的形式存在,大部分酵母snoRNA由独立基因编码,锥体虫snoRNA以多顺反子形式存在,果蝇snoRNA都位于内含子中。3.1storna基因的转录和修饰大多数脊椎动物的snoRNA产生于编码蛋白的内含子中,每一内含子至多产生一个snoRNA。这类snoRNA的宿主基因编码的蛋白质大多在核糖体的合成中起作用,这种特殊的组织形式说明了在细胞合成中各组分的协调表达。如非洲爪蟾的U86snoRNA就位于NOP56基因的一条长294nt的内含子中,且NOP56基因所编码的蛋白质NOP56正是BoxC/DsnoRNA的主要结合蛋白之一。然而,首先发现的U22宿主基因(UHG)有多个内含子,每一内含子至多编码一个snoRNA,这些snoRNA各不相同,而其外显子为非编码链(见图3e)。Gas5,U17HG和U19HG都是snoRNA的非编码宿主基因。Gas5编码10个不同的snoRNA,每一snoRNA对应一个内含子。Gas5是5′末端寡聚嘌呤基因家族的一员,其转录本与一个C核苷酸相连,后连一串多嘌呤。对非编码宿主基因的研究使人们认识到所有脊椎动物snoRNA宿主基因都是5′端富含嘌呤,这与5′-TOP-family基因与mRNA的翻译、调控有关是一致的。这些宿主基因最初可能编码某些蛋白质,但在进化过程中它们失去了蛋白质编码功能,而只是作为snoRNA基因的载体。SnoRNA也与其它功能RNA一样,要经过转录与转录后修饰等过程才能形成成熟的snoRNA。脊椎动物的内含子snoRNA与宿主基因一起转录后,通过剪接作用形成内含子分支套索结构,在外切酶的作用下去分支,被剪成线状,并经外切酶的修饰产生正确的5′、3′末端;少数情况下不需剪接作用,只要内切酶剪开mRNA前体,如非洲爪蟾的U16和U18。这两种情况都产生snoRNA前体,并被外切酶修饰成成熟snoRNA。也有少部分脊椎动物的snoRNA基因是独立转录的,如U3、U8、U13、MRPRNA。脊椎动物的U3、U8、U13、MRPRNA都有自己的启动子,其前体转录后在相关核酸酶的作用下修饰产生成熟的snoRNA。U3、U8、U13由RNA聚合酶Ⅱ转录,MRPRNA由RNA聚合酶Ⅲ转录。3.2不同植物中sorna基因簇的扩增基因簇是植物snoRNA的主要基因组织形式。玉米中,同一启动子转录1个H/ACA和4个C/DsnoRNA,它们形成共转录单元。在水稻和拟南芥中,都发现了位于内含子中的snoRNA基因簇。水稻的snoRNA基因组织形式以内含子基因簇为多,而拟南芥则以多顺反子为主。在基因簇中,有些是由同一snoRNA基因的多拷贝组成:如拟南芥的AtU14基因簇就是由4个拷贝的U14基因串联形成的;有的则是编码不同snoRNA:如拟南芥AtU51基因簇,这一基因簇是多顺反子,共编码十条snoRNA,前5条依序分别为:U31、snoR4、U33、U51及snoR5。后5条则是前5条的同顺序拷贝。这令人们很容易推想到AtU14极有可能是5条snoRNA所组成的基因簇扩增一次所得到的产物。簇的扩增现象不仅出现于多顺反子snoRNA基因簇中,内含子snoRNA基因簇中也发现了这一现象:水稻OsU51簇由U33、U51及snoR5组成单元的双拷贝形成,共6个snoRNA基因,见图4。这3个snoRNA基因恰巧与拟南芥AtU51簇的部分snoRNA基因是一致的,且排列顺序也一致。植物中独立转录的snoRNA基因簇在上游启动子的作用下转录成1个多顺反子的snoRNA前体,由于在snoRNA间隔序列中未发现类似启动子的结构,因而其成熟过程与酵母的相似,亦需要核酸内切酶与核酸外切酶的参与。目前,snoRNA基因簇的启动子以及终止信号尚未阐明,只知道植物多顺反子snoRNA基因簇的侧翼序列中不含有目前已知的由RNA聚合酶II或III指导转录的snRNA或U3snoRNA所特有的转录调控元件(如USE,TATA等)。因此,植物多顺反子snoRNA基因簇可能具有不同于植物snoRNA的启动子元件。高等植物的位于内含子的snoRNA基因簇明显与脊椎动物中“一个内含子一个snoRNA”的基因组织不同,因而具有不同的加工成熟机制。内含子基因簇的加工成熟需要核酸内切酶作的参与。目前在植物中发现了类似于酵母中参与snoRNA加工成熟的核酸内切酶与核酸外切酶的蛋白质,因此推测植物snoRNA多顺反子的加工成熟与酵母有相通之处,它们的加工成熟过程还有待进一步阐明。3.3酵母内含子storna大部分酵母snoRNA由独立基因编码,但也存在一些内含子snoRNA和多顺反子snoRNA基因簇。近期鉴定的酵母snR60-II基因是首个发现于酵母中的非蛋白质编码基因内含子所编码的snoRNA。酵母内含子snoRNA与脊椎动物内含子snoRNA一样,主要依赖剪接体的形成。无论是单个内含子基因还是多个成簇基因,单体的释放和成熟都需要内切酶剪切,外切酶修饰。酵母中多顺反子snoRNA前体由RNaseⅢ合成,修饰5′、3′两侧的酶为5′→3′外切酶Rat1p、Xrn1p;3′→5′外切酶是包含Rrp6p在内的exosome。酵母的单顺反子和多顺反子从含有TATAbox的启动子转录,这一启动子与参与核糖体蛋白基因表达的转录因子Rap1p结合。3.4锥体虫多顺反子c/d编码在锥体虫中也发现了很多snoRNA基因簇,它们都是以多顺反子的形式存在,尚未发现锥体虫中的内含子snoRNA基因簇。目前鉴定的锥体虫多顺反子snoRNA都为C/D,H/ACAsnoRNA混合编码,即同一snoRNA基因簇既编码BoxC/DsnoRNA又编码BoxH/ACAsnoRNA。snoRNA多顺反子由RNA聚合酶Ⅱ转录,成熟也需要内切酶的剪切和外切酶的修饰,类似于酵母多顺反子snoRNA的成熟,但其启动子序列尚未阐明。3.5果蝇storna基因近期发表的论文报道了果蝇体内不仅存在内含子snoRNA,还存在脊椎动物中不曾发现的内含子snoRNA基因簇。与脊椎动物一样,果蝇内含子snoRNA基因也存在像U22宿主基因一样的组织形式,见图3(e)。如DUHG1是果蝇中类似于人体内UHG的一条非编码RNA基因,它的16条内含子遵循每一内含子至多只编码一条snoRNA的方式,共编码16条boxC/DsnoRNA;果蝇的内含子基因簇也有只编码一种snoRNA(某一snoRNA基因多拷贝)和编码多种snoRNA(不同snoRNA基因串联)之分。3.6不同宿主基因编码的storna基因各snoRNA基因与其邻里基因的关系呈现多样性。对各