植物查尔酮合酶基因chs分子进化与功能趋异的关系

植物查尔酮合酶基因chs分子进化与功能趋异的关系

查尔酮合酶（chs，chaliane，ec.2.3.1.74）是黄酮和衍生物合成的第一步，也是黄色酮物质生物合成的速度酶。这是黄酮类物质生物合成的一种有限酶。这是由一分子香豆酸coa和三分子丙二醇（magoma）结合产生的4、5和7个羟基黄酮（narigeninchalianchalian）。类黄酮类物质广泛存在于高等植物,与植物的花色、花粉的发育以及生长素的运输等有关。此外,类黄酮在植物防御反应中也起到重要作用,如防UV辐射、真菌侵染以及豆科植物根瘤的形成等。豆科植物根瘤的形成就是由于真菌诱导CHS表达,造成类黄酮积累和随之而来的生长素局部浓度过高,最后使植物根部形成膨大的根瘤。因此CHS催化的类黄酮途径参与植物与微生物的相互作用。鉴于CHS成员在发育和环境调控中的双重作用,CHS基因家族成员分子进化和差异表达调控逐渐受到研究者重视。作为花色素合成的关键基因,CHS基因作为研究分子进化的模式基因具有很大的优势。如花色表型易于观察,花器官的颜色关系到昆虫的授粉以及物种生存,而物种生存是分子进化的根源。近年来,大量的CHS基因序列被克隆得到,为研究CHS基因的分子进化和表达调控提供了依据。自然选择和适者生存是生物各学科的交叉性问题,必须从有机体所在的生态环境、表型和分子机制等各级水平进行综合性的探讨和研究。本文以查尔酮合酶基因为例,结合国内外学者对该基因的研究以及作者近年来对兰科植物CHS基因分子进化的研究成果,对植物CHS基因家族成员的分子进化和功能趋异以及其中潜在的自然选择机制进行探讨。1基因贝的结构基因冗余是植物基因组的一个基本特征。在大多数物种中,CHS基因以多基因家族形式存在。在矮牵牛基因组中存在8～10个CHS基因。CHS基因在豆科植物中的拷贝数普遍较高,如在菜豆(Phaseolusvulgaris)和豌豆(Pisumsativum)中均发现了至少8个CHS基因。基因家族的形成源于基因重复。基因重复形成的新成员必须受正向选择(positiveselection),即必须对机体具有适应性(adaptation)意义、产生特定的新的生物学功能才能在长期的进化过程中保持自身的存在。否则,伴随着碱基插入、缺失及无义和移码突变,自然界天然存在的突变的压力最终会毫不留情的将其转化为假基因,最终在序列上无法辨识。新的基因拷贝在生物进化中有三种适应性意义:①增加有限的基因产物量;②其编码蛋白获得新的功能或活性修饰;③使机体对该类基因的表达调控更加精确特异,其中也许伴随着催化活性的细微变化,以便对该代谢途径加以优化。分子进化后发生的功能趋异属于后两种情况。许多具有不同功能的基因亚家族成员或者起源于共同祖先基因的基因重复,即在祖先物种中已经发生基因重复;或者起源于原有的兄弟亚家族成员的基因重复,即在某个物种形成以后发生的基因重复;它们共同组成该物种的超家族。如果这种进化和起源独立的出现于多个物种,即一个亚家族成员在某些物种独立的起源于自身物种兄弟亚家族成员的基因重复,称为趋同进化(convergentevolution),如植物CHS家族成员苯乙烯合酶(stilbenesynthase,STS),独立起源于CHS。如果在各物种分歧以前,基因家族成员已经分为几个不同功能的亚家族,则称为趋异进化(divergentevolution),如牵牛(Ipomoeapurpurea)CHS基因家族。一般来说,趋同进化发生的案例较少,受到的关注也比较少,趋异进化是基因家族成员形成的主要方式。2chs家族成员功能趋同进化的机制对不同植物CHS基因分子系统进化研究发现,根据其序列相同程度,来自同一个物种的CHS基因序列往往分成几个组。例如,在牵牛基因组中至今发现5个CHS基因,分别命名为CHSA、CHSB、CHSC、CHSD和CHSE。根据序列的相似程度,这5个基因分为2组。其中CHSD和CHSE形成的一组受到的选择压力大,形成的分支距离短;CHSA,CHSB,CHSC形成一个长距离分支,说明这一组基因受到的选择压力小,突变发生的频率高。根据表达谱分析,CHSD是花瓣中唯一负责花色素合成的CHS基因;而CHSE与花瓣筒组织内花色素的合成有关;CHSA、CHSB、CHSC在花器官组织中表达量很低,推测与花色素合成无关。体外酶活检测表明,只有缓慢进化的CHSD和CHSE可以催化柚皮苷查尔酮的合成,而CHSA、CHSB没有典型的查尔酮合酶催化活性,进一步揭示了牵牛CHS基因家族成员功能趋异性进化的机制。Ito等将豌豆(Pisumsativum)的8个CHS基因根据序列差异分为3组,对它们的表达进行鉴定,结果表明也存在CHS基因表达模式与序列同源程度一致的现象(图1),即序列同源程度高的基因表达模式也基本相同(包括组织特异性和环境诱导特异性),体现了序列和功能的一致性。在非洲菊(Gerberahybrida)中,确定功能的CHS有3个成员,GCHS1和GCHS3与花色素合成有关,而GCHS2由于3个关键氨基酸位点的突变(T197突变为L,G256突变为L,S338突变为I)造成底物结合和环化口袋变小,而使催化活性由CHS变为2-吡喃酮合酶(2-pyronesynthase,2-PS),不再参与类黄酮的合成。CHS家族成员STSs在松科植物、花生(Arachishypogaea)、葡萄(Vitisvat.optima.)都有报道。这一类基因可被真菌或其他逆境诱导表达,其产物主要与植物抗真菌有关。STS与CHS催化的底物相同,只是中间产物的闭环过程中发生缩合的原子不同,所以产物分别为查尔酮和苯乙烯。除了2-PS和STS,CHS基因超家族成员还包括苯基乙烷合酶基因(bibenzylsynthase,BBS)、吖啶酮合酶基因(acridonesynthaseACS)、异丙基苯基酮合酶基因(phlorisovalerophenonesynthase,PVPS)以及在欧洲花楸(Sorbusaucuparia)中新发现的联二苯合酶基因(Biphenylsynthase),各个成员之间具有60%左右的相似序列,执行不同的功能。最近的研究表明,苔藓CHS成员也分为几个亚家族,而且表达条件特异性各异,可能是被子植物CHS基因分子序列和功能趋异进化的前身。Jiang等对植物CHS和类CHS进行了全面系统进化分析,进一步证明植物CHS家族成员的基因重复和功能趋异在被子植物与裸子植物分歧以前就已经发生了。总之,早期所证明的CHS的各种功能,如与花色相关、参与植物抗真菌等,在CHS家族成员内部很可能是各有分工,各自负责。研究表明,各成员利用共同的底物丙二酰辅酶A,催化的都是酮聚酶缩合反应。区别在于典型CHS利用的另一底物是香豆酰辅酶A,催化生成查尔酮,进入花色素合成途径;其他成员利用的另外一个底物是香豆酸衍生物,生成不同产物,与植物抗逆(主要为抗真菌病害)有关。3兰科植物chs基因目前,数据库中兰科植物CHS基因序列发布的不多,针对基因功能和分子进化研究更是少之又少。目前兰科植物CHS研究主要集中在以下几个属,蝴蝶兰属(Phalaenopsis)、布隆兰属(Bromheadia)、石斛兰属(Dendrobium)和文心兰属(Oncidium)。与其他植物CHS基因一样,兰科植物CHS负责花色素的合成,受植物发育阶段特异性的调控。最近研究表明,兰科植物CHS基因的表达受到表观遗传调控,其上游启动子的甲基化状态控制其表达从而控制植物的花色。查尔酮合酶基因在多数物种中以多基因家族形式存在。Southern杂交表明,兰科植物CHS基因在已研究的各属都是由3～5个拷贝的小多基因家族组成。这为精细调节基因的表达提供了基础。这些基因家族成员在不同兰科物种中独立发生,这也是基因重复-分化(duplication-divergence)的进化意义之一。3.1布隆兰属chs基因的同源进化分析通过对蝴蝶兰(Phalaenopsishybrid)CHS基因家族成员的研究发现,蝴蝶兰CHS基因形成两个亚家族,即PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4聚在一起,而PHCHS5单独形成一个较遥远的分支(见图2)。有趣的是,取兰科植物三个属(蝴蝶兰属、石斛属和布隆兰属)的CHS序列做邻接树,发现这三个属CHS序列没有形成属特异性的分支,而是分为2个亚家族,其中PHCHS5、石斛兰唯一发布的一个CHS序列(命名为DHCHS)以及布隆兰属CHS2序列(BFCHS2)聚在一起,形成一个分支,命名为OCHS1组(OrchidCHS1group);PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4与布隆兰属CHS1(BFCHS1)聚在一起,形成快速进化的分支,该分支成员突变发生的频率高,命名为OCHS2组(OrchidCHS2group)。而且这两组成员序列差异很大,OCHS1成员与来自其他物种的CHS序列聚在一起,进化保守;而OCHS2成员形成一个长距离的分支,游离在被分析的所有植物CHS基因之外,说明这一组高度进化(图2)。上述同源进化分析表明,兰科CHS基因在这些属分歧发生以前已经分化成两个分支。从同源进化树看,OCHS1与亲缘关系较近的百合科植物(同属百合亚纲)CHS基因、以及禾本科CHS基因聚在一起,从祖先基因到分支形成的距离短,碱基突变频率低,说明位于该分支的CHS基因受到的选择压力大;OCHS2形成的是长距离分支,说明位于该分支的CHS基因受到的选择压力小,复制使这一分支产生后,碱基突变以加速方式进行。以生物信息学软件对蝴蝶兰两个亚家族成员相于对布隆兰属CHS直系同源基因的非同义突变频率进行计算,结果表明蝴蝶兰和布隆兰两个属形成以后,蝴蝶兰PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3、PHCHS4亚家族的进化速率是PHCHS5的1.5倍。就兰科植物来讲,由于到目前为止有关查尔酮合酶基因全长序列的报道仅限于上述三个属,而且石斛兰中仅OCHS1组CHS序列得到克隆测序,所以无法断定石斛兰CHS基因家族中是否有位于OCHS2分支的成员,是否兰科植物所有属的CHS基因都是以这种方式进化的,这些都有待于进一步研究验证。3.2chs基因家族以上对兰科植物CHS基因家族成员的系统进化分析表明,CHS基因在兰科植物各物种中是按照趋异进化的机制产生的,即在各物种分歧以前,CHS就已经形成了两个亚家族。对蝴蝶兰基因家族成员的差异表达鉴定为兰科植物CHS基因两个亚家族的功能趋异提供了进一步的证据。PHCHS5是唯一在蝴蝶兰花器官中大量表达的CHS基因,其表达的阶段与花色素合成时期一致。而PHCHS1、PHCHS2、PHCHS3和PHCHS4在花器官中表达量很低,与花色素合成没有明显的相关性。推测OCHS2成员主要负责植物的防御反应,而不是花色素的合成。序列比较结果表明,PHCHS4与蝴蝶兰中参与植物-微生物相互作用的苯基乙烷合酶(bibenzylsynthase,BBS)有很高的同源性(核苷酸水平约97%)。苯基乙烷合酶是兰科植物中研究比较深入的CHS超家族成员之一。在兰科植物球茎、地下茎和根中,存在大量的二羟菲,推测应该是酮聚化合物和丙苯(phenylpropane)代谢的联合产物。以灰霉菌对蝴蝶兰无菌幼苗进行侵染,发现苯基乙烷合酶和S-腺苷甲硫氨酸水解酶mRNA水平上调最明显,两者共同参与二羟菲合成途径参与兰科植物和微生物相互作用。对克隆到的苯BBS进行序列分析,发现与STS序列相似,都属于CHS超家族的成员。体外酶活分析表明,蝴蝶兰BBS利用二羟-香豆酸底物的效率高于利用香豆酰辅酶A的效率(CHS优先选择香豆酰辅酶A),该酶尤其表现出优先选择m-羟基化物作为底物的特性。因此,研究发现的OCHS2亚家族即为BBS亚家族。OCHS1和OCHS2可能来源于祖先CHS基因的复制,正向选择(positiveselection)使OCHS2序列发生的位点突变保留了下来,并且在进化中继续发生了更多有利于机体适应环境的突变,最后具有了新的功能,即整个分子进化过程是一个功能趋异性进化的过程,目的是为了更好的适应环境。兰花性喜温湿环境,很容易滋生霉菌,有多种兰科植物与真菌共生,这是兰科植物适应环境的典型例证。推测早期兰科植物的祖先就因为其喜温好湿的生活习性而深受灰霉菌其害。由于偶然的因素如DNA复制或者辐射的原因,一个拷贝的CHS基因发生了个别碱基的突变。获得突变拷贝的后代不仅没有死亡,反而对灰霉菌耐受性增强了,这样生物选择的作用使这种基因型保存了下来,而且该基因不断向有利于机体与灰霉菌相互作用的方向以高频率发生突变,逐渐失去了原来的样子,甚至这些突变基因还继续发生基因重复,使基因组中获得了几个该突变基因的拷贝。随着进化,CHS基因通过基因重复,变成了多拷贝的基因家族。与其他许多植物物种一样,兰科植物祖先还要靠鲜艳的花色吸引昆虫来授粉和繁殖,所以要保留一部分CHS基因拷贝来编码酶,催化花色素的合成,这部分成员进化保守,与其他植物CHS基因在序列上差异小,与高频进化的“兄弟”基因差别却很大,于是CHS基因家族成员形成了现在的序列差异很大的两个组,OCHS1和OCHS2。截至目前的研究来看,除了与兰科植物同为百合亚纲的薯蓣科薯蓣属(DioscoreaL.)植物中检测到过苯基乙烷,苯基乙烷衍生物二羟菲仅在兰科植物中发现,所以推测二羟菲途径是兰科植物特有的。目前尚未在兰科植物中发现除CHS和BBS之外的超家族成员。因为在薯蓣属和整个百合目(Liliales)中未有BBS基因序列发布,在薯蓣属也没有CHS序列被克隆到,所以无法对兰科植物和薯蓣属植物CHS基因超家族成员进行系统进化分析,也无法断定BBS在薯蓣科和兰科之间的进化地位。不过考虑到薯蓣属与兰科同属于百合亚纲,同时百合科植物现有的CHSs与兰科植物OCHS1成员序列相同程度比较高,亲缘关系较近(图2),BBS是否为百合亚纲特有也未可知。但是要推断BBS是在兰目植物(Orchidales)和百合目植物分歧以前还是以后出现,还有待进一步对百合科和薯蓣科植物BBS克隆鉴定后进行分析。另外,对兰目的另外一个科——水玉簪科(Burmanniaceae)CHS和BBS基因进行克隆测序,从而深入研究CHS基因超家族成员在百合亚纲和兰目中是否存在趋异进化机制也是很有意义的。值得一提的是,与一般植物花器官不同,兰科植物的萼片非绿色,而是与花瓣颜色和形状相同。来源于OCHS1的蝴蝶兰PHCHS5在花瓣中转录水平最高,但是在同样形状和颜色的萼片中几乎没有转录。与该结果相反,同样来源于OCHS1组的布隆兰BFCHS2(AF007097)在萼片中表达最高,而在花瓣中几乎没有表达。据此推测存在两种可能:①虽然同样来源于进化保守的OCHS1,并且同时负责花色素合成,但是在不同花器官中不同成员各有分工,比如在葡萄中,CHS2和CHS3而不是CHS1负责果实表皮花青素的合成。这是基因家族成员细微分工的证据,也是基因冗余的特点,其适应性意义可能是利于精细调节;②花瓣和萼片着色的时期不一致,导致负责花色素合成的CHS成员在两个器官表达时期不一致,比如,萼片着色早,所以CHS在发育早期的萼片中转录,而花瓣中CHS在花朵开放前表达达到顶峰。4灰霉菌的危害通过上述对三个兰科物种CHS基因的系统进化分析,可以得出初步的结论:①OCHS1负责化色素合成,属于典型CHS;OCHS2属于BBS,参与二羟菲合成途径。②兰科植物中CHS和BBS来源于趋异进化,即BBS不是在各个兰科物种独立发生,而是在兰科各属种分歧以前,祖先CHS基因已经发生基因重复,分别形成了今天负责花色素合成的CHS亚家族和负责对灰霉菌反应的BBS亚家族。兰科植物是开花植物中最大的家族之一,而且是单子叶植物中高度演化的一科,有6个亚科725个属2500余个种,几乎遍布全球,并表现出高度特异的形态、结构和生理特性。由于其奇特的叶型、花型和花色而深受人们的喜爱。随着人民生活水平的不断提高,对兰花的需求量越来越大。无论北方还是南方,各地花卉市场都有兰花专柜。兰花性喜温湿环境,如果兰室通风不畅很容易滋生霉菌,灰霉菌是兰科植物最常见的一种病害,又称花腐病。除危