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文档简介
材料与方法新型乳清蛋白功能基料的开发1前言1.1乳清蛋白概述1.1.1乳清蛋白简介乳清蛋白(wheyprotein)是一种营养丰富的全价蛋白质,作为干酪、干酪素等乳制品加工副产物,来源广泛、价格低廉,含有多种必需氨基酸。大约70%~80%的乳清蛋白是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白这两种小球蛋白。其他的蛋白成分包括凝乳乳清(大糖肽)、牛乳血清白蛋白、乳铁转移蛋白、免疫球蛋白、磷脂蛋白以及大量的生物活性因子和酶等1.1.2乳清蛋白的主要功能特性[2-3]有以下几个方面:(1)溶解性:主要是通过乳清蛋白与水的相互作用表现出来的性质。蛋白质的溶解性非常重要,它往往影响着蛋白质的其它的功能性质,其中受影响较大有起泡性、乳化胜和凝胶性等。影响蛋白质溶解性的因素可以分为内因和外因两个方面,内因主要包括蛋白质的分子量大小、形状、柔性、疏水性和亲水性之比、电荷的排布等;外因则主要指外在条件如:pH值,体系的温度,蛋白质的种类,加工工艺参数,溶剂的种类和蛋白质浓度大小等。(2)起泡性:乳清蛋白形成泡沫时有良好的表面活性作用,其良好的起泡性使乳清蛋白可以成为鸡蛋清有效的替代品。尤其是低脂肪的乳清浓缩蛋白,拥有很好的泡沫膨胀性能,因而可以延长起泡时间。(3)乳化性:乳清蛋白有优良的乳化性。乳清蛋白的每个分子同时含有亲水基团和疏水基团两种集团。当蛋白质溶解于水中时,亲水性的基团大多分布在外侧,表现为良好的水溶性质。在均质中,乳清蛋白往往可以吸附在脂肪球的表面,形成比较稳定的蛋白质和脂界面。从而起到防止脂肪球聚集的作用。(4)涂层性:乳清蛋白作为一种可食用性膜。可以用来提高产品的稳定性,美化外观,还可改善口感以及保护其独特的风味和香味。乳清蛋白膜还可以较好阻隔氧气和水分,具有良好的香味隔绝性和释放性能。(5)胶凝:乳清蛋白受热能形成热诱导性凝胶,并且可以保持大量的水分。在成胶作用的过程中,乳清蛋白还可以形成一种网状结构,从而将水分保留在其微小的空隙中。1.1.3乳清蛋白在食品中的应用乳清蛋白丰富的营养组成及良好的功能特性,使其在食品加工中有广泛的应用:(1)乳制品中的应用:在酸奶中添加一定量的乳清浓缩蛋白,能最大限度地防止益生菌在胃中遭到破坏,另外在肠道中还可以提高酶的活力。在脱脂和低脂的饮用型酸奶中,则往往会遇到风味方面产生的问题,特别是当产品含有水果时更易出现。乳清蛋白的胶凝性质在干酪生产中具有广泛的应用。WPC的最大用途是在冰淇淋的生产中,它作为廉价的蛋白质来源,还可用于替代脱脂乳粉降低产品的成本,赋予冰淇淋清新的乳香味。(2)在肉制品中的应用:各种植物类蛋白是肉制品加工中的主要配料之一,现在面临消费者需求的多元化选择。在食品中添加乳清浓缩蛋白、乳清分离蛋白等乳源蛋白配料,可以赋予肉制品健康的形象和营养标签,引起了许多生产者和消费者的关注。把乳清蛋白用在肉制品行业,可以很好地发挥应有的作用,体现良好的效果。(3)在运动类保健食品中的应用:乳清蛋白具有易于消化的优质蛋白质,能提供额外能量,节约体内蛋白质,亮氨酸及异亮氨酸等支链氨基酸含量丰富。这对于运动员骨骸肌的能量供应、肌肉合成以及延缓中枢疲劳均有极大的帮助。富含半肤氨酸和蛋氨酸。含谷氨酸,有助于肌糖元更新并防止因过度训练导致的免疫功能下降。是生物可利用钙的良好来源,能减少运动期间发生骨折并防止雌性激素不足的女运动员发生骨质流失。(4)在焙烤食品中的应用:在面包、糕点等焙烤食品中,乳清蛋白可作为完全或部分替代品。在焙烤食品(面包、蛋糕和曲奇)生产中,乳清蛋白可以增大面包的体积、提高水分的含量,使面包芯更加柔软。特别是添加钙含量较低的乳清浓缩蛋白,这一效果则更为明显。在蛋糕加工中,可用乳清浓缩蛋白代替鸡蛋,能够提高蛋白糊的硬度和粘度,从而有效地防止由膨松剂产生的CO2的逸出。在曲奇和软质曲奇加工中WPC除可作为鸡蛋的替代物外,还可用于改善全脂和低脂曲奇的颜色和咀嚼性。另外乳清蛋白与乳糖混合可赋予食品均匀的状态和较好的口味。(5)化妆品行业中的应用:乳清蛋白营养物质丰富,营养因子分布均衡,对美容有很大好处。β-Lg对黑色素产生的抑制作用和提高细胞膜抗氧化性的能力,使其在化妆品领域具有潜在的应用前景。综上可知,虽然乳清蛋白已在食品行业多个方面有所应用,但多数是作为食品辅料在食品工业中应用,其抗氧化功能在食品及其它行业应用不多。因此,加强和改善乳清蛋白的功能特性,扩大其作为添加剂及在其他领域的应用将会大大提高乳清蛋白的应用价值。1.2常见的蛋白质改性方法及特点目前,国内外已采用很多方法改善蛋白质的功能特性,主要有酶法改性、化学改性、物理改性和基因工程改性等[4],均是通过改变乳清蛋白的分子大小、结构、氨基酸组成和顺序、表面静电荷的分布和疏水基团等,从而达到增强或改善其功能特性的目的。1.2.1酶法改性酶法改性是指通过将特定的酶作用于蛋白质,使其发生水解或交联来改变蛋白结构,从而起到改善蛋白质功能特性的作用。乳清蛋白的酶法改性通常采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和碱性蛋白酶等对蛋白质进行水解,还可以利用转谷氨酰胺酶对蛋白质进行酶法交联。对蛋白质进行有限酶解,能够改善其功能性质(溶解性,乳化性和起泡性)。酶可以部分降解乳清蛋白的多肽骨架,增加其分子内或分子间交联,从而改变蛋白质的功能性质。Asselin研究发现用胃蛋白酶以及碱性蛋白酶水解乳清蛋白,酶解产物的抗原性降低[5]。沈浥使用胰蛋白酶水解乳清蛋白,水解后的产物具有较强的抗氧化能力,这是由于在水解过程中抗氧化肽的生成[6]。蛋白酶通过类蛋白反应(Plasteilireaction)可使蛋白质发生交联,产生具有良好流变学性质的聚合物,这在质构化食品中非常有用。酶法改性过程中采用蛋白酶处理乳清蛋白,酶解产物虽然也具有较强的抗氧化活性[7],但同时会导致大量苦味物质的生成,严重影响产品风味,给生产加工带来不便。具有反应条件温和、速度快、反应完全、副产物少和专一性强等特点,是当今研究蛋白质改性最为重要的改性技术之一。1.2.2化学改性化学改性是指在蛋白质中添加化学试剂,从而使一部分肽键断开,或者引入其它功能基团。利用蛋白质侧链基团的化学活性不同,可以选择性地将某些基团转化成相关衍生物,从而改善其功能特性,如溶解性、乳化性、疏水性、凝胶性及其他性质等。化学改性的实质是改变蛋白质的结构、静电荷、疏水基团来影响其功能特性。需要使用化学试剂,这样会产生一些毒副作用,目前普遍不采用。乳清蛋白的化学改性主要是通过对蛋白分子中氨基酸残基的侧链基团(例如赖氨酸残基的εWoo通过磷酸化得到的β-乳球蛋白凝胶,比同样条件下的天然β-乳球蛋白形成的凝胶稳定性提高了30%[8]。乳清蛋白的磺化是通过亚硫酸盐与二硫键发生反应来改变蛋白的结构和功能,提高其乳化性和消化性。该方法能裂解二硫键,对二硫键和或半胱氨酸残基具有很高的特异性,因此对其它氨基酸的生物利用率影响不大,对肽和蛋白质不存在副反应[9]。Medrano将葡萄糖和乳糖引入β-乳球蛋白后得到的产物,起泡性和泡沫稳定性均有提高[10]。化学改性由于彻底改变了分子的结构,改性后的产物性质通常有较大程度的改善,但是在此过程中除糖基化作用是在加热条件下不添加其它化学试剂发生外,其它方法均需添加一定的化学试剂,反应过程中往往产生毒副作用,不适合作为食品辅料使用。因此,糖基化将是蛋白质化学改性的一个重要方向。1.2.3物理改性蛋白质的物理改性主要是指通过加热、冷冻、高压、电场、声场、机械作用、低剂量辐射及添加小分子双亲物质等物理手段来改善蛋白质的功能特性方法[11]。加热会导致乳清蛋白变性,可影响它的天然状态和稳定性。温和热处理可以在一定范围提高乳清蛋白的起泡性,而高温处理反而使其起泡性有所降低[12]。这是因为低温加热时,部分乳清蛋白分子展开,而导致疏水性氨基酸残基的暴露,使其能在水气界面很好的定位[13]。Anet采用不同强度的超声处理乳清蛋白,发现高强度的超声通过改变蛋白的温度和导电性而影响蛋白的溶解性及泡沫性质等功能特性,而低强度的超声对其溶解性及泡沫性质影响不大[14]。Meza研究发现冷冻处理使未加热的乳清蛋白凝胶的粘性范围变大,但是同样条件下加热的的乳清蛋凝胶的粘性范围反而变小,可能是由于冷冻处理对凝胶结构发生了一定的变化[15]。物理改性一般只改变蛋白的高级结构,具有加工费用低、耗时少、无毒副作用、对蛋白营养价值破坏小的优点,缺点是改性范围窄,大多集中在表面性质上,同时可能会造成蛋白的溶解性等功能特性降低。1.3蛋白质糖基化的原理及方法1.3.1蛋白质糖基化的原理基于Maillard反应机理的蛋白质糖基化,是指通过糖与蛋白质的α或ε-氨基共价连接而形成糖基化蛋白的过程,属于蛋白质的化学改性范畴。Maillard反应又称非酶褐变(Non-enzymaticBrowning),是由法国生物化学家LouisCamilleMaillard在1912年发现,1953年JohnHodge等正式命名此反应为Maillard反应。反应历程可分为三个阶段,即反应初期、中期和末期[16-18]。(1)初期阶段:碳水化合物的醛基与蛋白质的氨基进行缩合反应形成糖基化产物(Shiff碱),再经环化形成相应的N-取代醛糖基胺,经Amadori重排形成Amadori化合物。第一阶段基本上没有色素和风味物质的形成;(2)中期阶段:Amadori化合物在中间阶段进行的反应,主要取决于体系的pH值,当pH≤7时,Amadori化合物发生1,2-烯醇化反应而形成糠醛(Furfural)或羟甲基糠醛(Hydromethyl-furfural),当pH>7,Amadori化合物发生2,3-烯醇化反应,产生还原酮类和一类裂解产物。所有这些产物都具有较高的活性,进一步参与反。此阶段生成的杂环类化合物对己醛氧化有较强的抑制作用[19],而还原酮则具有还原能力和鳌合作用[20(3)末期阶段:在反应末期,成环、脱水、重排、异构等一系列反应均在进行,在最终反应阶段,高级Maillard反应阶段形成的众多活性中间体,又可继续与氨基酸反应,最终都形成含氮的棕色聚合体,统称为类黑素(Mlanoidin)。类黑素分为分子量低于1000Da和达100000Da两类有色物质。在食品加工特别是热处理工艺中,形成的类黑素不仅直接影响着食品的风味、色泽和质地,而且具有较强的抗氧化作用[21-221.3.2蛋白质糖基化的方法制备方法主要有两种,包括干热方法和湿热方法。近年来还出现了有机溶剂湿热法、微波辅助湿热法等其他糖基化方法。1.3.2.1干热制备方法干热糖基化方法首先由日本Yamaguchi大学的Kato教授[提出[23],通过控制自发的美拉德反应来实现,多用于蛋白质和多糖之间的反应。主要包括以下几个步骤:(1)将蛋白质和多糖按一定的比例溶解在选定pH值的缓冲溶液里(或去离子水中);(2)分散均匀后进行冷冻干燥;(3)冷冻干燥好的样品在一定的温度(一般50-60℃)和相对湿度(一般用饱和KBr维持在79%或饱和KI维持在65%的相对湿度)下反应。干热方法需要进行前处理,反应时间相对相对较长,对反应条件的控制较为严格,,在反应过程中可能会产生不溶性的大分子物质,在反应过程中很难进行过程化控制;但反应后测定方便,且由于温度适中,反应前后颜色变化不是特别大,在食品工业中应用范围较广。1.3.2.2湿热方法相对简单,将蛋白质和多糖按一定的比例溶解在选定pH值的缓冲溶液里(或去离子水中),取一定量配好的溶液置于密闭的设备中,在一定温度下油浴(或水浴)加热反应。湿热方法主要用于蛋白质与单糖或双糖之间的反应,在较短时间内即可发生程度较深的反应,反应周期短,但是褐变严重,生成的产物颜色较深,可能会限制其在食品中的应用。1.3.2.3近几年来,对于糖基化方法的改进研究较多。齐军茹研究了有机溶剂湿热法对大豆分离蛋白和葡聚糖的糖基化改性,产物的功能特性(如乳化性、溶解性、热稳定性)与大豆分离蛋白相比得到了明显的提高[24];管军军利用了微波辅助湿热法进行了大豆分离蛋白和乳糖、可溶性淀粉改性的可行性研究,对反应的工艺条件、机理、接枝物的理化性质、机构及功能特性等方面进行了系统的研究[25];王金水运用超声波辅助湿热法研究了小麦蛋白分别和阿拉伯胶、麦芽糊精的糖基化反应[26]。利用改进后的糖基化方法、反应时间和产物的功能特性都有相应提高,但是这些新的糖基化方法和传统的方法一样仍旧难以实现大分子的蛋白质和多糖的过程化控制,并且所利用的微波、有机溶剂、超声波等条件对于实现工业化、规模化的生产实践均有一定难度。1.4.乳清蛋白的糖基化研究进展近几年的研究发现,糖基化作用可以有效的改善乳清蛋白的功能特性。国外在利用糖基化共价修饰技术改善乳清蛋白功能特性方面的研究较早,Kitabatake等以葡萄糖酸和6-O--半乳糖-D-葡萄糖酸作为糖基供体,对-乳球蛋白进行糖基化反应,结果表明合成的糖基化蛋白在天然-乳球蛋白的等电点pH值时,其溶解度有明显的提高,而且随着糖基化程度的提高,糖基化蛋白的热稳定性逐渐提高[27],但未对其它的功能特性(如乳化、凝胶特性等)进行深入研究。Hattori分别将氨基葡聚糖、壳聚糖等阳离子低聚糖引入β-乳球蛋白,研究结果表明β-乳球蛋白-多糖共价复合物的乳化活性较β-乳球蛋白有所提高,抗原性和免疫原性均比β-乳球蛋白低[28]。Akhtar等人研究发现,在酸性条件下,乳清蛋白-葡聚糖共价复合物的乳化稳定性和乳清蛋白相比,有一定提高[29]。Yuanxia等人研究在一定条件下阿洛糖以及两种食用糖(葡萄糖和果糖)对a-乳白蛋白性质的影响。对三种α-乳白蛋白糖基化产物进行研究发现,经过阿洛糖修饰的糖基化产物具有较强的四唑盐(XTT)还原能力和ABTS自由基清除能力,但并未对其它糖类的糖基化产物的抗氧化性质进行研究[30]。Beatriz等研究发现经壳聚糖修饰的β-乳球蛋白在干热反应的前2天,pH值为4条件下的乳化活性和抗菌性均有提高,之后下降[31]。Bongkosh等研究了β-乳球蛋白和硫酸葡聚糖的复合物在中性条件下的热稳定性,发现在pH5.6–6.2之间,较低浓度硫酸葡聚糖的条件下,β-乳球蛋白的热稳定性得到改善[32]。Medrano将葡萄糖和乳糖引入β-乳球蛋白后得到的产物,起泡性和泡沫稳定性均有提高,但并未对其它性质进行研究[10]。国内也有一些学者对乳清蛋白的糖基化产物进行了研究。中国农业大学食品科学与营养工程学院芦晶,布冠好等人对乳清蛋白-壳聚糖复合物的功能特性进行了一系列的研究,指出复合物的溶解性,热稳定性及乳化性质在一定的H离子浓度下,一定的盐离子浓度下和乳清蛋白相比有一定程度的提高[33]。郑喆等研究表明乳清蛋白-葡萄糖糖基化产物的溶解性和热稳定性明显改善[34]。刘春波等经研究发现糖基化反应能够明显改善乳清蛋白-乳糖复合物的乳化性和乳化稳定性[35]。以上研究表明,糖基化反应可以改善乳清蛋白的一些功能特性,如:溶解性、乳化性、热稳定性等性质。但对于糖基化产物的抗氧化性质研究较少,且不同种类糖的乳清蛋白糖基化产物的抗氧化性质并未有系统的研究。1.5抗氧化能力的检测方法检测物质的抗氧化活性强弱有多种测定方法,本文主要介绍下面几种。1.5.1自由基清除能力的检测方法1.5.1.11,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH法是一种简单,方便,易于操作,灵敏,可靠的方法。DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基,含有一个单电子,在517nm处有特征吸收峰,其乙醇水溶液呈深紫色。加入被测样品后,被测样品清除DPPH自由基而引起吸光值的减少,根据清除程度反映其抗氧化能力的强弱。另外,因为该自由基只有一个单电子,也可以应用电子自旋共振法来检测。对于不同的抗氧化剂,其抗氧化能力可根据清除50%原始DPPH浓度所需抗氧化剂量(IC50)1.5.1.2ABTS(2,2'-Azinobis-ABTS(2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)与过氧化物酶(例如高铁肌红蛋白)和氢过氧化物在一起时形成蓝绿色ABTS+•阳离子自由基,该法是以ABTS这种水溶性的自由基引发剂为显色剂。向溶液加入被测物质,如果该物质中存在抗氧化成分,则该物质会与ABTS+•发生反应而使反应体系褪色,从而通过光吸收值的下降程度反映抗氧化能力,结果多表示为达到一定浓度测试物质相当的抗氧化能力所需要的Trolox的浓度,所以也把该方法称为TEAC(Troloxequivalentantioxidantcapacity)法[42]。1.5.1羟自由基清除能力的测定,可以采取多种方法[43],主要包括:电子自旋共振法外、比色法(水杨酸法、铁氧化邻二氮菲法、脱氧核糖法、萃取—催化氧化光度法)、化学发光法、荧光法(羟-对苯二甲酸荧光法、Ce3+荧光法)等。1.5.1基本原理:由于自由基带有未成对电子特点,使它具有很多正常分子所不具备特性,如自由基都具有吸磁性,这是自由基最大特点之一。由此,产生研究自由基一种特殊仪器一电子自旋共振谱仪,简称ESR仪。利用ESR仪能很容易区别测定出多种不同自由基,对于反应活性高、寿命短的自由基的直接测定法,目前就可用ESR法[44]。1.5.2FRAP(Ferricreducingabilityofplasma)测定FRAP方法即三价铁离子还原法,由Benzie提出,该方法的原理是基于氧化还原反应的比色法。可以把非酶抗氧化剂看作还原剂,它能将氧化物质还原来达到抗氧化的目的。在较低pH值环境下,三价复合物Fe3+-二吡啶三亚嗪(ferric-tripyridyl-triazine,Fe3+-TPTZ)可被抗氧化剂还原成二价铁的形式,呈现出明显的蓝色,并于593nm处产生最大的光吸收,在Fe3+-TPTZ过量的时,蓝色物质的生成量就可以反映待测样品的还原能力,即物质总抗氧化能力[451.5.3脂质过氧化检测方法1.5.3脂质过氧化反应的最终产物有丙二醛(malondialdehyde,MDA),MDA可破坏蛋白质等生物大分子,造成机体老化和多种疾病的发生,其含量与多种疾病的发生及年龄的增长呈正相关,性质比较稳定,便于检测。因此,测定MDA的含量,在一定程度上反映了脂质过氧化损伤的程度,是目前比较认可的反映脂质过氧化的指标。硫代巴比妥酸试验是将2-硫代巴比妥酸和脂类的氧化产物丙二醛作用,能够生成一种粉红色的化合物,该化合物在532nm处有最大吸光值,即为TBA值。丙二醛被称为硫代巴比妥酸反应物(thriobarbituricacidreactivesubstances,TBARS),TBA值与其含量呈化学计量关系,由于抗氧化剂能够抑制TBARS的生成,故其抑制率可以用来衡量抗氧化剂对脂质过氧化的抑制作用,TBA法常用于检测被测样品是否对生物体系(如红细胞、脂蛋白、组织匀浆、肝微粒体、肝线粒体、肝细胞等)1.5.3油脂中含有多种不饱和脂肪酸类。油脂受热时,就会发生氧化反应等一系列得化学变化,从而使油脂产生变质。所以测定氧化反应中过氧化物的含量,可以间接地反应抗氧化剂的活性强弱。油脂稳定性的常用测定方法是检测油脂在氧化过程中的过氧化值的大小。过氧化值的测定通常采用传统的化学分析法:用淀粉作为指示剂,采用硫代硫酸钠滴定被氧化的碘化钾的量作为指标。1.5.3不饱和脂肪酸在其氧化过程中可以形成共轭双键,共轭双键能够吸收波长处在230~235nm的紫外光,具有抗氧化作用的物质能够延长形成共扼双键的时间。利用抗氧化剂的这种性质可以测定抗氧化剂的活性大小。该法适用于对纯脂的过氧化研究,非脂质过氧化会干扰检测[46]。1.6课题研究的意义及研究内容1.6.1立题意义乳清蛋白是一种营养丰富的全价蛋白质,适合作为食品加工的基料,但是其某些不良的理化特性限制了其应用范围,因此,加强和改善乳清蛋白的功能特性,扩大其在食品及其他领域的应用,成为国内外科学家们研究的热点。目前,国内外已采用很多方法改善蛋白质的功能特性,主要有酶法、化学法、物理法和基因工程法。化学法主要应用琥珀酰化、磷酸化,脱氨基等作用,需要使用化学试剂,这样会产生一些毒副作用,目前普遍不采用;酶法采用蛋白酶处理乳清蛋白,酶解反应会导致大量苦味物质的生成,严重影响产品风味;物理法主要研究集中在蛋白质的热处理、挤压、蒸煮等方面,可导致乳清蛋白的溶解性等功能特性降低;基因工程法是通过重组蛋白质的合成基因来改善蛋白质的功能性质,可能存在潜在的安全危害。糖基化反应修饰技术可改善乳清蛋白的功能特性,与化学和酶法改性等方法相比,糖基化反应修饰技术不需化学试剂,安全性较高,可极大改善乳清蛋白的乳化性、溶解性及热稳定性等功能特性。但是,利用糖基化反应修饰技术,提高乳清蛋白抗氧化活性的研究相对较少,缺少相应的基础理论研究,亟待阐明乳清蛋白糖基化反应的抗氧化机制。本课题拟以乳清分离蛋白为研究对象,利用不同类型的还原糖与乳清蛋白发生糖基化反应,制备出具有强抗氧化活性的乳清蛋白糖基化产物。利用荧光光谱以及电泳等分析技术,研究乳清蛋白糖基化反应特性,阐明糖基化反应修饰后的乳清蛋白的结构与抗氧化活性的相关性,为新型、天然抗氧化剂在食品中应用提供技术支撑。本课题所采用的湿热制备方法简便易行、易于控制、成本较低。因此,本课题的研究具有很高的理论研究价值和实际应用意义,也为乳清蛋白的利用和食品工业中抗氧化剂的来源提供了一条新途径。2材料与方法2.1试验材料2.1.1原料和主要试剂试剂与原料名称生产单位或购买单位十二烷基磺酸钠(SDS)Sigma公司,美国邻苯二甲醛(OPA)Sigma公司,美国2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH)Sigma公司,美国乳清蛋白分离物(WPI)北京MilkyWay商业公司核糖北京索莱宝科技有限公司半乳糖上海市蓝季科技发展有限公司乳糖天津市科密欧化学试剂有限公司氢氧化钠天津市东正精细化学试剂厂磷酸氢二钠天津市博迪化工有限公司铁氰化钾天津市博迪化工有限公司磷酸二氢钠天津市耀华化学试剂有限责任公司盐酸天津市耀华化学试剂有限责任公司脲西陇化工股份有限公司甲醇天津市光复精细化工研究所无水乙醇天津基准化学试剂有限公司过硫酸钾天津市凯通化学试剂有限公司三氯化铁天津市双船化学试剂厂β-巯基乙醇天津市光复精细化工研究所三氯乙酸上海凌峰化学试剂有限公司以上药品除特殊说明外均为分析纯2.1.1仪器和设备名称生产厂家UV-2401PC紫外可见分光光度计日本岛津公司F-4500型荧光分光光度计日本日立公司GL-21M离心机上海市离心机械研究所KQ3200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司pH计赛多利斯科学仪器(北京)有限公司AL-104精密电子天平梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司DK-8B电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司电子恒温油浴锅江苏金坛市亿通电子有限公司漩涡混合器上海琪特分析仪器有限公司冻干机德国CHRIST2.2试验方法2.2.1糖基化反应产物的制备将糖和乳清蛋白按照一定的比例制成溶液放在带塞玻璃试管内,在一定的起始pH值和一定温度下,油浴反应一定时间取出样品,测定其pH值,-20℃储存备用。2.2.2褐变程度的测定参照Ajandouz等人[47]的方法,并略作修改。将待测样品采用蒸馏水进行12倍稀释,测定其在420nm条件下的吸光值;同时将待测样品在420nm测定基础上采用蒸馏水进行5倍稀释,测定其在294nm条件下的吸光值。2.2.3游离氨基的测定采用OPA方法,参照Oyaizu等人[48]的方法,并略作修改。100mL邻苯二甲醛(OPA)试剂含:50mL浓度为0.1mol/L硼酸盐缓冲液,5mL质量分数为20%的SDS溶液,80mgOPA(溶于2mL甲醇),200μL-巯基乙醇。取样品液100μL(质量分数0.5%)和3mLOPA试剂混合,室温暗处反应5min后,340nm处测其吸光值。以L-亮氨酸为标准物,按上述方法绘制出亮氨酸浓度与吸光值之间的标准曲线回归方程,根据测定样品的吸光值,利用标准曲线方程,计算得出样品中的游离氨基浓度。2.2.4还原能力测定参照Oyaizu的方法[49],并略作修改。取样品0.5mL(现将样品配成1%的溶液),加入2.5mL磷酸盐缓冲液(浓度为0.2mol/L,pH值为6.6)和2.5mL的1%铁氰化钾溶液,混合均匀。再将混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷却,加入2.5mL的10%的三氯乙酸溶液,然后将混合物在3000r/min下离心10min。取2.5mL上层清液,加入2.5mL蒸馏水和0.5mL的0.1%的氯化铁溶液2.2.5DPPH自由基清除能力的测定参照Saiga的方法[50],并略作修改。将样品配成20g/L的质量浓度,取样品液1.0mL及4.0mL浓度为0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液(体积分数为95%),混匀,室温下避光反应30min。用体积分数为95%乙醇溶液作参比,于517nm测定吸光值。根据下式计算每种样品液对DPPH自由基的清除率:清除率=(1-)×式中:Ai为加样品液后DPPH溶液的吸光值;Aj为样品液的吸光值;Ac为未加样品液时DPPH溶液的吸光值。2.3试验设计2.3.将乳清蛋白和3种糖类(核糖、半乳糖、乳糖)分别按1:1(质量比)的比例溶于纯净水,制成总固形物质量浓度为60g/L的溶液,调节起始pH值为8。在油浴温度分别为75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃的条件下反应3小时。将制备好的样品迅速冷却至室温,测定pH值,冷冻贮存备用。2.3.将乳清蛋白和3种糖类(核糖、半乳糖、乳糖)按质量比分别为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3(糖/乳清蛋白)的比例溶于纯净水,制成总固形物质量浓度为60g/L的溶液,调节起始pH值为8。在油浴温度为90℃的条件下反应3小时。将制备好的样品迅速冷却至室温,测定pH值,冷冻贮存备用。2.3.将乳清蛋白和3种糖类(核糖、半乳糖、乳糖)分别按1:1(质量比)的比例溶于纯净水,制成总固形物质量浓度为60g/L的溶液,调节起始pH值分别为7、8、9、10、11、12。在油浴温度为90℃的条件下反应3小时。将制备好的样品迅速冷却至室温,测定pH值,冷冻贮存备用。2.3.在前三部分试验的基础上,研究不同的反应时间对乳清蛋白糖基化反应特性的影响。将乳清蛋白和3种糖类(核糖、半乳糖、乳糖)分别按1:1(质量比)的比例溶于纯净水,制成总固形物质量浓度为60g/L的溶液,调节起始pH值分别为9。油浴温度为95℃的条件下分别在0、0.5、1、2、3、4、5h取样。将制备好的样品迅速冷却至室温,测定pH值,冷冻贮存备用。2.3.选取不同时间条件下制取的核糖-WPI、半乳糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI4种糖基复合物,进行一定浓度的稀释,研究其电泳谱图及荧光强度的变化。2.3.在上述试验的基础上,我们选取核糖-WPI、半乳糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI4种糖基复合物,研究底物浓度和体系pH值对糖基复合物抗氧化活性的影响,为其在实践中应用提供一定的理论基础。其中在研究pH值对糖基复合物抗氧化活性的影响中,溶剂分别为:醋酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH5);磷酸酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH6-8);碳酸盐缓冲液(0.05mol/L,pH9-10)本部分的试验样品取自2.2.3.选取BHA、Vc两种常用的食品抗氧化剂,采用3种抗氧化检测方法测定2.32.4统计方法数据统计分析采用SPSS13.0软件,数据均以平均值±标准差表示(n=3)。画图采用Origin75软件。3结果与分析3.1乳清蛋白糖基化反应的动力学研究3.1.1温度对乳清蛋白复合物褐变程度及抗氧化活性的影响3.1.1.1温度对乳清蛋白及其糖基复合物褐变程度的影响一般来说,反应产物的颜色是糖基化反应程度的重要表观标志,且反应程度与颜色正相关。在糖基化反应过程中,420nm和294nm处的吸光值来监测反应的褐变程度。420nm处的吸光值反映了糖基化反应程度的大小,吸光值越大,说明其最终反应程度越大,反之则较小。而294nm处的吸光值主要反映糖基化反应中间产物的颜色,在一定程度上反映了糖基化的程度。将原反应液进行12倍稀释,测定反应后的复合物在420nm处的吸光值;在420nm测定液基础上5倍稀释,测定其在294nm的吸光值。测定结果如表3-1(A)和(B)所示。表3-1(A)WPI及其糖基化复合物在420nm处的吸光值Tab.3-1(A)Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA42075°C80°C85°C90°C95°C100°CWPI0.082±0.001a0.082±0.002a0.088±0.004a0.089±0.003a0.094±0.002a0.099±0.003a核糖-WPI0.173±0.001a0.303±0.001b0.468±0.003c0.538±0.002d1.095±0.004e1.463±0.004f半乳糖-WPI0.072±0.001a0.080±0.003a0.106±0.001b0.110±0.001c0.191±0.002d0.270±0.003e葡萄糖-WPI0.062±0.002a0.072±0.003a0.080±0.002b0.089±0.002b0.101±0.002c0.146±0.002d果糖-WPI0.070±0.002a0.067±0.002a0.085±0.004b0.097±0.003c0.117±0.003d0.169±0.002e乳糖-WPI0.064±0.002a0.056±0.003a0.071±0.001a0.082±0.004b0.085±0.002b0.105±0.001c菊粉-WPI0.102±0.001a0.095±0.004a0.112±0.001b0.126±0.002c0.136±0.003c0.138±0.003c注:分别对不同温度下的每组数据进行方差分析。a=0.05;字母在同一行数据中,相同表示差异不显著,不同表示差异显著。下同由表3-1(A)的方差分析的多重比较结果结果可知,单独加热WPI时,其420nm的吸光值随温度的升高变化不显著(p>0.05);核糖-WPI的吸光值随反应的温度升高显著增大(p<0.05);半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI在75℃和80℃的吸光变化不显著(p>0.05),而当反应温度升至85℃吸光值显著增大(p<0.05);乳糖-WPI和乳糖-WPI的吸光值在整个反应过程中变化较小。由测定结果可知,多数糖基化复合物在75℃和80℃的吸光值变化不大,甚至略有下降。此后,吸光值随着温度的升高而增大。其中核糖-WPI吸光值随温度升高吸光值增幅最大,75℃加热时的吸光值远远大于其它复合物。其次分别为半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>菊粉-WPI>乳糖-WPI。单独加热WPI颜色变化很小。表3-1(B)WPI及其糖基化复合物在294nm处的吸光值Tab.3-1(B)Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA29475°C80°C85°C90°C95°C100°CWPI0.166±0.003a0.160±0.017a0.187±0.002b0.197±0.006b0.200±0.001b0.197±0.002b核糖-WPI0.425±0.001a0.599±0.005b0.793±0.002c0.816±0.005d1.499±0.011e1.814±0.022f半乳糖-WPI0.187±0.001a0.208±0.002b0.228±0.001c0.290±0.002d0.427±0.001e0.530±0.003f葡萄糖-WPI0.171±0.001a0.183±0.002a0.192±0.002b0.216±0.001c0.260±0.003d0.330±0.010e果糖-WPI0.186±0.007a0.183±0.006a0.216±0.005b0.232±0.007c0.284±0.057d0.356±0.005e乳糖-WPI0.174±0.001a0.171±0.007a0.203±0.005b0.207±0.006b0.222±0.006c0.229±0.007c菊粉-WPI0.202±0.006a0.175±0.007b0.222±0.006c0.223±0.006c0.226±0.004c0.236±0.005c由表3-1(B)的方差分析的多重比较结果可知,随着反应温度的增加,WPI的吸光值变化差异不显著(p>0.05);随反应温度升高,核糖-WPI和半乳糖-WPI在294nm的吸光值差异显著(p<0.05);果糖-WPI和葡萄糖-WPI的吸光值在75℃和80℃的吸光值变化差异不显著(p>0.05),而当反应温度升至85℃吸光值显著增大(p<0.05);乳糖-WPI在相邻的两个温度范围(75℃和80℃、85℃和90℃、95℃和100℃)的吸光值变化差异不显著(p>0.05);菊粉-WPI则在85-100℃加热时吸光值变化不显著(p>0.05)。由此可知,WPI及其它糖基复合物的吸光值随温度升高多数呈现上升趋势。其中核糖-WPI的吸光值受反应温度影响最大,说明其中间产物颜色最深;其次分别为半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI。WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI不同糖基复合物的褐变程度不同,主要是因为参加反应的糖的活性不同。据研究,还原糖的反应活性为:醛基戊糖>醛基己糖>酮基己糖>二糖。由果糖得到的糖基复合物比葡萄糖的褐变程度大,可能是因为果糖比葡萄糖含有的开链结构比例高的缘故[55]。3.1.1.2温度对乳清蛋白及其糖基复合物抗氧化性质的影响1)温度对乳清蛋白及其糖基复合物还原能力的影响糖基化复合物具有一定的抗氧化作用[56],而抗氧化效果的强弱与还原能力存在一定的联系。该方法的测定是以测定的样品是否为良好的电子供体为重要标志,还原能力强的样品往往是优良的电子供体,测定样品所供应的电子能将Fe3+还原成Fe2+的同时,与自由基发生反应,从而使自由基成为更稳定的物质。这样就可以中断自由基的连锁反应[57]。复合物在700nm处吸光值越大,表明其还原力越强。在不同反应温度条件下,不同类型糖基化反应产物的还原能力结果,见图3-1所示。图3-1不同温度下WPI及其糖基化产物的还原能力Fig.3-1ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesatdifferenttemperature由图3-1可以看出,WPI随着反应温度的升高,还原能力几乎没有变化。而WPI复合物的还原能力则随着温度升高有不同程度的提高:其中核糖-WPI复合物的还原能力明显优于其它糖基复合物,75℃时的还原能力值已相当于半乳糖-WPI在100℃时的1.8倍;半乳糖-WPI在100℃时的还原能力是75℃的4.3倍;果糖-WPI在100℃时的还原能力略高于葡萄糖-WPI,分别是其对应75℃的4.5和3.6倍;乳糖-WPI在100℃反应的还原能力仍较低,但相对于75℃提高了2.4倍;菊粉-WPI的还原能力则随温度的升高变化不大。由结果可知,糖基复合物还原能力强弱分别为核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI,核糖-WPI、半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI的还原能力随温度升高而增大,乳糖-WPI和菊粉-WPI的还原能力随温度变化平缓。除核糖-WPI外的其它糖基复合物,在75和80℃加热时,还原能力变化不大。2)温度对乳清蛋白及其糖基复合物DPPH自由基清除能力的影响DPPH自由基经常被用来衡量抗氧化剂的抗氧化活性。DPPH·是一种比较稳定的自由基,其乙醇溶液呈紫色,该溶液在5l7nm处有最大吸收。当自由基清除剂存在时,由于DPPH·的单电子被配对,使DPPH·浓度减小,从而导致其颜色由紫色变为黄色,同时溶液在517nm波长处的吸光值变小[58]。清除剂可直接作用于DPPH·自由基,且反应时间较短,操作简便易行。在不同反应温度条件下,不同类型糖基化反应产物的DPPH自由基清除能力结果,见图3-2所示。图3-2不同温度下WPI及其糖基化产物的DPPH自由基清除能力Fig.3-2TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesatdifferenttemperature由图3-2可知,WPI及其糖基复合物的DPPH自由基清除能力随温度升高的变化情况可以分为3类:(1)核糖-WPI:该复合物在75℃反应时已达到62.33%,此后随温度升高仍有所提高,和其它糖基复合物相比具有明显的优势;(2)半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI和果糖-WPI:这3种复合物的DPPH自由基清除能力虽不及核糖-WPI,但在75℃时已具有40%以上的清除力,且随着温度的升高而不断提高;(3)WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI:这3种物质的DPPH自由基清除能力均较弱,最高不到40%,可能是由于乳糖、菊粉与WPI反应较慢,在该实验条件下并未生成具有较强抗氧化性质的产物。从中可以看出,不同种类WPI糖基复合物的DPPH自由基清除能力随温度的升高提高幅度不大,温度从75℃到100℃,葡萄糖-WPI清除能力提高最多,为原来的1.4倍。在相同温度下反应,核糖-WPI的清除能力最高,其次分别为半乳糖-WP>葡萄糖-WPI>果糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。WPI和菊粉WPI的清除能力变化不大。3.1.2糖和WPI质量比对糖基化褐变程度及抗氧化性质的影响3.1.2.1质量比对乳清蛋白及其糖基复合物褐变程度的影响将原反应液进行12倍稀释,测定反应后物质的420nm的吸光值;在420nm测定液基础上5倍稀释,测定294nm的吸光值。测定结果分别如表3-2(A)和(B)所示。表3-2(A)WPI及其糖基化复合物在420nm处的吸光值Tab.3-1(A)Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA4203:12:11:11:21:3WPI对照0.042±0.001a0.061±0.003b0.080±0.005c0.106±0.004d0.147±0.002e核糖-WPI0.480±0.009a0.622±0.004b0.799±0.004c0.789±0.004c0.701±0.009d半乳糖-WPI0.103±0.004a0.137±0.002b0.186±0.003c0.226±0.001d0.250±0.002e葡萄糖-WPI0.076±0.002a0.097±0.001b0.148±0.002c0.189±0.001d0.216±0.007e果糖-WPI0.099±0.002a0.111±0.001b0.147±0.002c0.189±0.005d0.210±0.001e乳糖-WPI0.060±0.001a0.081±0.001b0.121±0.004c0.156±0.001d0.180±0.003e菊粉-WPI0.067±0.003a0.064±0.003a0.107±0.011b0.143±0.003c0.147±0.004c由表3-2(A)中方差分析的多重比较结果可知,核糖-WPI的吸光值在质量比1:1和1:2差异不显著(p>0.05),在其它质量比差异显著(p<0.05);菊粉-WPI在质量比3:1和2:1及1:2和1:3差异不显著(p>0.05);WPI及各糖基化复合物在420nm的吸光值随WPI含量的提高差异显著(p<0.05)。其中核糖-WPI复合物在质量比为1:1时吸光值最大,且在相同条件下和其它糖基化复合物相比吸光值最大;半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI均随着WPI含量的提高,吸光值也随之升高。同样条件下吸光值的大小依次为核糖-WPI>半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。表3-2(B)WPI及其糖基化复合物在294nm处的吸光值Tab.3-2(B)Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA2943:12:11:11:21:3WPI对照0.079±0.003a0.102±0.003b0.161±0.003c0.215±0.004d0.249±0.003e核糖-WPI0.697±0.005a0.880±0.011b1.220±0.006c1.173±0.007d1.156±0.011e半乳糖-WPI0.178±0.002a0.243±0.002b0.324±0.006c0.372±0.008d0.409±0.005e葡萄糖-WPI0.131±0.002a0.168±0.003b0.248±0.004c0.305±0.002d0.329±0.010e果糖-WPI0.178±0.003a0.202±0.002b0.249±0.002c0.294±0.004d0.322±0.003e乳糖-WPI0.101±0.001a0.130±0.003b0.194±0.005c0.248±0.003d0.267±0.001e菊粉-WPI0.107±0.002a0.122±0.003b0.176±0.002c0.228±0.004d0.268±0.007e由表3-2(B)中方差分析的多重比较结果可知,WPI及糖基化复合物在294nm的吸光值随WPI含量的提高差异显著(p<0.05)。其中核糖-WPI在质量比为1:1时吸光值最大;半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI随着WPI含量的提高,吸光值也随之升高。同样条件下吸光值的大小依次为核糖-WPI>半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。3.1.2.3质量比对乳清蛋白及其糖基复合物抗氧化性质的影响1)质量比对乳清蛋白及其糖基复合物还原能力的影响将原反应液进行6倍稀释,测定其还原能力,结果如图3-3所示。图3-3不同质量比条件下WPI及其糖基化产物的还原能力Fig.3-3ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentmassratio由图3-3可以看出,6种糖基复合物在糖和WPI质量比为1:1时,还原能力达到最大。相同条件下,核糖-WPI的还原能力远远高出其它糖基复合物;其次分别为半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。除核糖-WPI外,质量比对还原能力的影响不是很大。不同质量比的糖基复合物的还原能力,以糖和质量比为1:1为分界点,呈现先升高后降低的特点。可能是糖和蛋白在质量1:1时反应程度相对较大,因此还原能力最强。2)质量比对乳清蛋白及其糖基复合物DPPH自由基清除能力的影响在原反应液基础上6倍稀释,测定其DPPH自由基清除能力,结果如图3-4所示。图3-4不同质量比条件下WPI及其糖基化产物的DPPH自由基清除能力Fig.3-4TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentmassratio由图3-4可知,除菊粉-WPI外,其它糖基复合物均在质量比为1:1时有最大的自由基清除能力;菊粉-WPI在质量比为2:1时最高,且各种糖基复合物随WPI含量的提高变化较小。相同条件下,核糖-WPI的自由基清除能力明显高于其它糖基复合物。在质量比为1:1时,清除率达到72.67%,是同等条件下半乳糖-WPI的1.6倍,菊粉-WPI的3.3倍。不同质量比的条件下,DPPH自由基的清除能力以此为核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。在不同糖和乳清蛋白质量比的反应条件下,6种糖基复合物的还原能力和DPPH自由基清除能力的变化趋势基本一致,均是在质量比1:1时达到最大值。3.1.3起始pH值对糖基化反应特性及抗氧化性质的影响3.1.3.1起始pH值对乳清蛋白糖基化复合物褐变程度的影响将原反应液进行24倍稀释,测定反应后物质的420nm的吸光值;在420nm测定液基础上5倍稀释,测定294nm的吸光值。测定结果分别如表3-3(A)和(B)所示。3-3(A)WPI及其糖基化复合物在420nm处的吸光值Tab.3-3(A)Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA420789101112WPI0.067±0.004a0.065±0.003a0.065±0.003a0.063±0.002a0.065±0.003a0.076±0.004a核糖-WPI0.501±0.008a0.430±0.006b0.390±0.008c0.428±0.003b0.676±0.005e0.872±0.004f半乳糖-WPI0.112±0.005a0.108±0.001a0.132±0.001b0.208±0.003c0.532±0.005d0.719±0.006e葡萄糖-WPI0.072±0.002a0.066±0.001a0.083±0.003b0.119±0.002c0.315±0.007d0.680±0.008e果糖-WPI0.078±0.003a0.077±0.002a0.098±0.003b0.155±0.004c0.385±0.011d0.798±0.003e乳糖-WPI0.069±0.003a0.072±0.001a0.085±0.001b0.115±0.002c0.247±0.008d0.494±0.010e菊粉-WPI0.077±0.001a0.078±0.001a0.080±0.001a0.084±0.002a0.140±0.003b0.199±0.005c由表3-3(A)方差分析的多重比较结果可知,WPI在420nm处的吸光值随起始pH值的升高差异不显著(p>0.05);核糖-WPI在420nm处的吸光值随pH的变化差异显著(p<0.05),但是吸光值的大小呈现先增大后减小的趋势;半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI和乳糖-WPI的吸光值除在pH7和8的吸光值差异不显著(p>0.05)外,随着起始pH值的升高而显著增加(p<0.05);菊粉-WPI的吸光值随着起始pH值升高到10以后显著增加(p<0.05)。3-3(B)WPI及其糖基化复合物在294nm处的吸光值Tab.3-3(B)Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA294789101112WPI0.097±0.005a0.084±0.002a0.085±0.005a0.087±0.006a0.097±0.004a0.099±0.005a核糖-WPI0.661±0.009a
0.622±0.009b0.625±0.003b0.644±0.005c0.879±0.012d1.426±0.010e半乳糖-WPI0.195±0.009a0.182±0.004a0.204±0.001b0.263±0.006c0.641±0.002d1.115±0.017e葡萄糖-WPI0.124±0.002a0.119±0.005a0.146±0.004b0.184±0.004c0.463±0.004d1.249±0.007e果糖-WPI0.123±0.004a0.124±0ha0.161±0.004b0.229±0.004c0.548±0.012d1.530±0.030e乳糖-WPI0.103±0.002a0.105±0.002a0.144±0.002b0.161±0.002c0.272±0.006d0.679±0.014e菊粉-WPI0.108±0.002b0.100±0.001a0.102±0.001a0.111±0.002b0.184±0.005c0.215±0.004d由表3-3(B)方差分析的多重比较结果可知,WPI随起始pH值的升高吸光值差异不显著(p>0.05);核糖-WPI的吸光值除在pH8和9其它差异显著(p<0.05);半乳糖-WPI、果糖-WPI和乳糖-WPI除在pH7和8之外,其它差异显著(p<0.05);葡萄糖-WPI在294nm处的吸光值随pH的变化差异显著(p<0.05);菊粉-WPI在起始pH7-9的吸光值差异不显著(p>0.05);在pH10-12时吸光值差异显著(p<0.05),。由测定结果可知,起始pH7到8对糖基复合物的吸光度影响不大;pH由8到10,吸光度缓慢增加;pH到10以后,吸光度迅速增大。由此可知,碱性环境对糖基复合物褐变程度影响较大。3.1.3.2起始pH值对乳清蛋白及其糖基复合物抗氧化性质的影响1)起始pH值对乳清蛋白及其糖基复合物还原能力的影响在原液基础上稀释12倍,测定其还原能力,结果如表3-4所示。表3-4不同起始pH条件下WPI及其糖基化产物的还原能力Tab.3-4ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentinitialpHA700789101112WPI0.034±0.003a0.036±0.004a0.035±0.005a0.042±0.008a0.088±0.003b0.135±0.005c核糖-WPI0.781±0.003a0.762±0.011a0.749±0.010b0.689±0.010c0.824±0.011d1.130±0.034e半乳糖-WPI0.186±0.006a0.223±0.006b0.238±0.003b0.291±0.006c0.619±0.012d1.015±0.015e葡萄糖-WPI0.156±0.011a0.178±0.005b0.197±0.001b0.231±0.003c0.475±0.011d1.022±0.021e果糖-WPI0.079±0.003a0.107±0.010b0.163±0.006c0.254±0.005d0.565±0.009e1.190±0.009f乳糖-WPI0.077±0.001a0.091±0.007b0.156±0.003c0.193±0.006d0.405±0.008e0.674±0.006f菊粉-WPI0.044±0.003a0.047±0.002a0.059±0.002b0.066±0.001b0.166±0.006c0.250±0.010d由表3-4可知,除核糖-WPI外,WPI及其它糖基复合物的还原能力随着起始pH值的升高有不同程度的提高。WPI的还原能力在起始pH7-10之间差异不显著(p>0.05),在pH10-12之间显著提高(p<0.05);核糖-WPI的还原能力在pH7和8之间差异不显著(p>0.05),在pH8-12之间差异显著(p<0.05),且以pH值10为分界点,呈现先降低后升高的趋势;半乳糖-WPI和葡萄糖-WPI的还原能力在pH8-9之间差异不显著(p<0.05),在其它pH差异显著(p<0.05);果糖-WPI和乳糖-WPI的还原能力随着起始pH值的升高显著提高(p<0.05);菊粉-WPI在7-8及9-10之间的还原能力差异不显著(p>0.05),在pH提高到11后,还原能力明显提高(p<0.05)。其中,核糖-WPI的还原能力在起始pH值7-11时,明显优于其它糖基复合物;在起始pH12时,核糖-WPI、半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI四种复合物的还原能力基本相当;乳糖-WPI的还原能力逐步提高,菊粉-WPI的还原能力变化较小。由表中测定结果还可以得到如下结论:WPI及其糖基复合物在起始pH7-10之间,还原能力提高缓慢,而当起始pH增至10以后,还原能力迅速提高。这可能是由于强碱性环境促进了蛋白质的分解,从而加速了糖基化反应。2)起始pH值对乳清蛋白及其糖基复合物DPPH自由基清除能力的影响在原液基础上稀释12倍,测定其DPPH自由基清除能力,结果如表3-5所示。表3-5不同起始pH值条件下WPI及其糖基化产物的DPPH自由基清除能力Tab.3-5TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentinitialpHIP(%)789101112WPI11.24±0.96a6.91±1.27b9.27±1.32c15.23±0.83d17.87±0.77e11.97±0.29a核糖-WPI82.73±0.99a76.59±1.41b71.49±0.55c51.41±1.38d30.01±0.72e34.48±0.72f半乳糖-WPI23.53±1.10a31.17±0.55b33.75±0.78c37.07±0.24d30.55±1.65b46.34±1.03e葡萄糖-WPI11.42±0.59a11.86±0.64a15.72±0.45b24.40±0.68c45.19±0.74d38.26±0.89e果糖-WPI21.54±0.94a24.05±0.73b35.44±0.32c53.33±1.38d49.23±0.46e45.03±0.62f乳糖-WPI10.86±1.18a9.33±0.57a18.11±1.10b31.67±0.88c47.58±0.89d44.90±0.97e菊粉-WPI4.91±0.63a6.08±0.68a9.59±0.51b13.04±1.02c26.70±0.84d8.36±0.77b由表中方差分析的多重比较结果可知,WPI在起始pH7-11之间反应后的DPPH自由基清除能力差异显著(p<0.05),在起始pH7和12时差异不显著(p>0.05);核糖-WPI和果糖-WPI的自由基清除能力随pH的变化差异显著(p<0.05);半乳糖-WPI除在起始pH8和11外,其它差异显著(p<0.05);葡萄糖-WPI和乳糖-WPI除在pH7和8外,在其它起始pH值时DPPH自由基清除能力差异显著(p<0.05);菊粉-WPI在起始pH9和11之间的清除能力差异显著(p<0.05)。随着起始pH值的升高,WPI及其糖基复合物的DPPH自由基清除能力并不表现出特定的规律。从表可以看出,核糖-WPI的DPPH自由基清除能力随着起始pH的升高呈现下降趋势,起始pH值为7时,清除率高达82.73%,而当起始pH值升为12时,清除率只有34.48%,下降了58%;半乳糖-WPI的DPPH自由基清除能力在pH值为11时出现降低,之后升高;WPI及其它糖基复合物则在起始pH值12时出现DPPH自由基清除能力降低的现象。由测定结果可知,核糖-WPI的DPPH自由基清除能力随着起始pH的升高呈现下降趋势;半乳糖-WPI的DPPH自由基清除能力在pH值为11时出现降低,之后升高;WPI及其它糖基复合物则在起始pH值12时出现降低的特性。由此可知,较高的起始pH值环境,并不利于糖基化反应产物DPPH自由基清除能力的提高。3.1.4反应时间对糖基化反应特性及抗氧化性质的影响3.1.4.1反应时间对乳清蛋白及其糖基复合物褐变程度的影响将原反应液进行12倍稀释,测定反应后物质的420nm的吸光值;在420nm测定液基础上5倍稀释,测定294nm的吸光值。测定结果分别如表3-6(A)和(B)所示。3-6(A)WPI及其糖基化复合物在420nm处的吸光值Tab.3-6(A)Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA4200(h)0.512345WPI0.124±0.010a0.125±0.002a0.124±0.003a0.124±0.001a0.125±0.004a0.123±0.004a0.124±0.003a核糖-WPI0.118±0.001a0.199±0.001b0.353±0.002c0.698±0.001d1.013±0.012e1.170±0.015f1.467±0.036g半乳糖-WPI0.125±0.002a0.133±0.002b0.157±0.002c0.211±0.002d0.270±0.002e0.314±0.002f0.364±0.002g葡萄糖-WPI0.126±0.002a0.124±0.001a0.130±0.002b0.159±0.002c0.194±0.002d0.214±0.002e0.238±0.002f果糖-WPI0.126±0.001a0.136±0.002b0.155±0.002c0.202±0.002d0.233±0.002e0.271±0.002f0.314±0.002g乳糖-WPI0.127±0.002a0.115±0.002b0.122±0.002c0.144±0.002d0.165±0.002e0.187±0.002f0.204±0.001g菊粉-WPI0.155±0.06a0.141±0.003a0.142±0.004a0.145±0.002a0.146±0.004a0.154±0.003a0.158±.0.005a由表3-6(A)方差分析的多重比较结果可知,WPI和菊粉-WPI在420nm处的吸光值随反应时间的增加差异不显著(p>0.05);葡萄糖-WPI的吸光值在加热1-5h内差异显著(p<0.05);其它糖基复合物在420nm处的吸光值随反应时间的增加差异显著(p<0.05)。由表中测定结果可知,除WPI及菊粉-WPI外,多数糖基复合物在420nm的吸光值随着反应时间的增加而增大[64-65]。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大,颜色最深,5h的吸光值是0h的12.4倍;六碳糖中半乳糖-WPI颜色最深,果糖-WPI和葡萄糖-WPI稍浅一些,反应后的吸光值分别是0h的2.9倍,2.5倍和1.9倍;乳糖-WPI的吸光值升高较少,吸光值是反应前的1.6倍,WPI和菊粉-WPI吸光值变化不大。420nm的吸光值依次为核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI,颜色也依次变浅。3-6(B)WPI及其糖基化复合物在420nm处的吸光值Tab.3-6(B)Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA2940(h)0.512345WPI0.190±0.001a0.180±0.002b0.185±0.002c0.186±0.002c0.184±0.002c0.186±0.002c0.189±0.001a核糖-WPI0.172±0.001a0.393±0.001b0.660±0.003c1.107±0.004d1.433±0.004e1.559±0.004f1.845±0.004g半乳-WPI0.177±0.002a0.197±0.002b0.250±0.002c0.341±0.001d0.438±0.001e0.511±0.002f0.593±0.002g葡萄糖-WPI0.191±0.002a0.194±0.002a0.214±0.001b0.265±0.001c0.330±0.002d0.366±0.002e0.404±0.002f果糖-WPI0.186±0.001a0.220±0.001b0.257±0.001c0.333±0.002d0.383±0.002e0.445±0.003f0.504±0.002g乳糖-WPI0.178±0.002a0.167±0.001b0.193±0.001c0.239±0.002d0.253±0.002e0.267±0.002f0.283±0.003g菊粉-WPI0.193±0.001a0.192±0.002a0.191±0.002a0.201±0.002b0.202±0.002b0.214±0.001c0.220±0.002d由表3-6(B)方差分析的多重比较结果可知,WPI和菊粉-WPI在294nm处的吸光值随反应时间的增加差异不显著(p>0.05);葡萄糖-WPI的吸光值在加热1-5h内差异显著(p<0.05);其它糖基复合物在420nm处的吸光值随反应时间的增加差异显著(p<0.05)。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大,5h的吸光值是0h的10.7倍;六碳糖中依次为半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI,反应后的吸光值分别是0h的3.4倍,2.7倍和2.1倍;乳糖-WPI的吸光值升高较少,吸光值是反应前的1.6倍;WPI和菊粉-WPI吸光值变化不大。由测定结果可知,大多糖基复合物在294nm处的吸光值都随时间的增加而增大。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大;其余依次为半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。3.1.4.2反应时间对乳清蛋白及其糖基复合物游离氨基含量的影响以0h的WPI及糖和WPI的游离氨基酸含量为基准,测定反应后的游离氨基酸含量。以反应后的游离氨基酸含量占0h的百分比表示。将原反应液进行12倍稀释,测定游离氨基的变化,结果如图3-5所示。图3-5不同反应时间条件下WPI及其糖基化产物的游离氨基酸含量Fig.3-5Thefreeaminogrou
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